Параганглиомы головы и шеи имеют нейроэндокринное происхождение, высоковаскуляризированы и чаще всего формируются из двух параганглиев — каротидного и вагального. Согласно современной классификации Всемирной организации здравоохранения, их относят к категории опухолей с вариабельным потенциалом метастазирования [1], что объясняется способностью к малигнизации и агрессивному течению [2, 3]. Такие состояния, как и возможные нежелательные последствия лечения параганглиом, приводят к значительному ухудшению качества жизни — сдавливанию сонных артерий и других кровеносных сосудов, нарушению мозгового кровообращения, увеличению риска возникновения инсультов, дисфагии, головных болей, нарушений ритма сна и бодрствования, а также расстройств репродуктивных функций [4—8].

В зависимости от локализации параганглия и, по-видимому, генетических особенностей популяции количество пациентов со злокачественным течением заболевания может существенно варьировать от 3 до 30%, по данным разных источников [9, 10]. Формально это значение может зависеть также от уровня организации первичной медицинской помощи в регионе, так как при позднем обращении к врачу и развитии заболевания в течение длительного времени даже неагрессивная опухоль может уже диссеминировать в прилежащие ткани, лимфатические узлы и другие органы [11]. Частота возникновения рецидивов зависит и от особенностей хирургической школы в каждой отдельной клинике, поскольку объем проводимой операции может существенно различаться. Злокачественное течение проявляется чаще всего в мультифокальном росте, инвазии капсулы и прилежащих тканей, а также в способности рецидивировать и образовывать метастазы главным образом в лимфатические узлы и легкие [4].

До 30—40% параганглиом обусловлено наличием герминальных мутаций в одном или нескольких онкоассоциированных генах. Однако часто выявляют также соматические потенциально драйверные мутации, которые могут быть сами по себе или совместно с герминальными вариантами ассоциированы с формированием и прогрессией параганглиом [10, 12, 13]. Наследственные параганглиомы встречаются в составе опухолевых синдромов (например, группа синдромов множественных эндокринных неоплазий) либо в качестве одиночных неоплазий [14]. Большинство наследственных случаев связано с мутациями в генах SDHx, кодирующих субъединицы сукцинатдегидрогеназы (митохондриального комплекса II) [15—17]. Таким образом, как и во многих злокачественных опухолях, при параганглиомах происходят нарушения, связанные с энергетическим обменом [18—22]. Известно более 30 генов, ассоциированных с развитием параганглиом [23]. Однако примерно в трети опухолей в этих генах не удается идентифицировать драйверные мутации [13].

Современные высокопроизводительные технологии, такие как анализ экзома, транскриптома, микроРНК, метилома, протеома, и способы их биоинформатической обработки позволяют не только проводить работы по идентификации известных мутаций, но и выявлять новые. Параллельно эти инструменты помогают выявить молекулярные нарушения, которые связаны с той или иной мутацией, например на уровне экспрессии мРНК или белка [24, 25]. Ранее нами было проведено секвенирование экзома 52 образцов каротидных параганглиом, для 25 из которых также получены данные транскриптомного анализа [13]. После поиска мутаций в генах, для которых ранее продемонстрирована вовлеченность в развитие нейроэндокринных опухолей, в 40% образцов потенциально драйверных нарушений выявлено не было. Это позволяет предположить, что в развитие каротидных параганглиом могут быть вовлечены другие гены, ранее не описанные. Роль драйверных мутаций в развитии опухоли во многих случаях объясняется их влиянием на экспрессию соответствующих генов и белков. Для их идентификации использовали предсказательный алгоритм xseq, который сопоставляет наличие мутаций в генах с изменением их экспрессии на уровне мРНК, т. е. выявляет гены, мутации в которых могут быть функционально значимыми [26]. Такие мутации играют ключевую роль в изменении нормальных клеточных процессов, что приводит к установлению злокачественного фенотипа опухоли. Мутации в трех генах (MYH15, CSP1 и MYH3), идентифицированных при помощи алгоритма xseq, подробно проанализированы.

Секвенирование экзома и транскриптома. В работе использованы данные секвенирования экзома, описанные нами ранее [13]. Данные секвенирования доступны в ресурсе NCBI Sequence Read Archive (project ID: PRJNA411769). Приготовление библиотек для секвенирования экзома 52 образцов каротидных параганглиом проводили с использованием набора Nextera Rapid Capture Exome Kit (Illumina, США). Высокопроизводительное секвенирование осуществляли на приборе NextSeq 500 System (Illumina) в режиме парных прочтений длиной 75 нуклеотидов. Для 25 образцов из этой выборки также получены данные секвенирования транскриптома.

Суммарная РНК из парафиновых блоков выделена с использованием набора High Pure FFPET RNA Isolation Kit («Roche», Швейцария). Концентрацию РНК определяли при помощи флуориметра Qubit 2.0 («Invitrogen», США). Целостность РНК оценивали на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer («Agilent Technologies», США). Библиотеки мРНК из архивного материала приготовлены с использованием набора TruSeq Stranded Total RNA LT with RiboZero TM Gold (Illumina). Секвенирование транскриптома осуществляли на приборе HiSeq2500 (Illumina) в режиме парных прочтений длиной 100 нуклеотидов в компании Евроген (Россия). Работы по подготовке экзомных и тканскриптомных библиотек, секвенированию экзома, а также биоинформатической обработке данных выполнены на оборудовании ЦКП «Геном» ИМБ РАН (http://www.eimb.ru/rus/ckp/ccu_genome_c.php).

Биоинформатический анализ. Ранее в 52 образцах каротидных параганглиом были описаны только мутации в 42 генах, которые с наибольшей вероятностью ассоциированы с развитием этих опухолей [13]. Однако для всех генов создан список вариантов, который и был использован в этой работе. «Сырые» данные в формате *.fastq.gz выравнивали на референсный геном (hg19) с помощью программы bwa mem. Затем полученные файлы формата *.bam отсортировали и очищали от дупликатов, используя пакет программ SAMtools. Поиск мутаций осуществляли с помощью программы freebayes, фильтрацию обнаруженных вариантов — vcffilter из пакета программ vcflib. Аннотацию вариантов провели с помощью SNPSift из пакета SNPEff. Информацию о найденных вариантах собрали из баз данных dbSNP, dbNSFP, ClinVar, MutationTaster, SIFT, PolyPhen2, FATHMM, phastCons, PhyloP, 1000 Genomes Project, ExAC, COSMIC, GO, ConsensusPathDB и OMIM.

Первым шагом анализа «сырых» данных секвенирования транскриптома была оценка качества полученных прочтений (ридов, reads) при помощи программного пакета FASTQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/publications.html). Далее проводили процедуру выравнивания (alignment) прочтений на референсный геном (GRCh38) при помощи программного пакета Kallisto (https://pachterlab.github.io/kallisto/). Эти программы обеспечивают псевдовыравнивание на референсный геном: каждому транскрипту ставятся в соответствие прочтения без применения процедуры выравнивания индивидуальных нуклеотидов. Для каждого транскрипта указывается количество соответствующих ему индивидуальных прочтений, нормализованных на 1 млн (TPM, transcripts per million).

На основе полученных данных проведен поиск новых генов, которые потенциально могут быть вовлечены в образование каротидных параганглиом — т. е. часто содержат драйверные мутации. Для этого использован алгоритм xseq, осуществляющий поиск генов, мутации в которых приводят к изменению экспрессии. Этот алгоритм ранее протестирован на данных проекта «The Cancer Genome Atlas» (TCGA), что подтвердило возможность его применения для эффективной идентификации функциональных мутаций в геномах злокачественных опухолей [26]. В основе xseq лежит иерархическая байесовская модель, которая анализирует три типа данных: матрицу экспрессии генов у исследуемой выборки пациентов, матрицу соматических мутаций этих генов в той же выборке и граф, отражающий биохимические связи между исследуемыми генами (например, из баз данных биохимических путей). Модель рассчитывает апостериорную вероятность влияния мутаций на уровень экспрессии соответствующих генов на уровне всей выборки, а также для каждого образца отдельно. Для каждого гена алгоритм рассчитывает 2 параметра: P (D) — вероятность того, что замены нуклеотидной последовательности данного гена ассоциированы с изменениями экспрессии всей выборки образцов, и P (F) — вероятность того, что изменение экспрессии в конкретном образце ассоциировано с вариациями в данном гене. Таким образом, данный алгоритм позволяет выявлять гены, в которых находятся потенциально драйверные мутации. Поскольку коллекцию каротидных параганглиом собирали с 1990 г., для многих пациентов парные неопухолевые образцы были недоступны, что не позволяет провести точное исключение герминальных вариантов, поэтому они были исключены методами биоинформатики. Из анализа с использованием алгоритма xseq были удалены мутации с частотой встречаемости в группе здоровых индивидов более 1% по базам данных ExAc и 1000 Genomes Project, эти варианты приняты в работе как условно соматические. Такой метод фильтрации не исключает категорию герминальных драйверных мутаций, так как они встречаются в популяции также с очень низкой частотой. Далее, уже после выбора конкретных генов, с наибольшей вероятностью вовлеченных в формирование каротидных параганглиом, порог фильтрации для них был снижен до 2%, чтобы подробно рассмотреть все потенциально драйверные мутации.

Алгоритм xseq позволил выявить гены, в которых генетические варианты предположительно влияют на их уровень экспрессии. В итоговом списке оказалось 16 генов: MYH15, CSP1, MYH3, PTGES3L, CSGALNACT2, NMD3, IFI44, GMCL1, LSP1, PPFIBP2, RBL2, MAGED1, CNIH3, STRA6, SLC6A13 и ATM, для которых значение P (F) составляло более 0,5. Для дальнейшего анализа отобраны первые три гена – MYH15, CSP1 и MYH3, которые имеют наибольшие значения обоих параметров (более 0,9). При этом 4-й в списке ген (PTGES3L) демонстрирует резкое уменьшение значений P (D) (0,8) и P (F) (0,77).

Среди 3 генов, с наибольшей вероятностью вовлеченных в патогенез каротидных параганглиом, для дальнейшего анализа выбран ген MYH3, так как в нем обнаружено больше всего различающихся мутаций (без учета мутаций, характерных для большинства образцов выборки). Применены менее строгие параметры фильтрации по частоте встречаемости в популяции здоровых индивидов, в рассмотрение были включены мутации, которые встречаются в выборке ExAC и 1000 Genomes Project с частотой не более 2%.

В 42 образцах каротидных параганглиом выявлено 13 различных генетических вариантов в гене MYH3. Из дальнейшего анализа были исключены замены, располагающиеся в области интронов (rs3216884, rs36968047 и rs188588330), и один из вариантов (rs3216884), обнаруженный в 37 исследуемых образцах. Также были исключены синонимичные замены — rs17817203 и chr17:10558250 C>T (rs-идентификатор у данного варианта отсутствует).

Далее приведено описание основных потенциально драйверных мутаций в гене MYH3, которые были выявлены при анализе экзома 52 образцов каротидных параганглиом.

Редкая мутация в гене MYH3 — NM_002470: p. Ile264Thr/c.791T>C (rs763347751, chr17: 10550688) обнаружена в одном образце каротидных параганглиом. Данная мутация, согласно предсказательным алгоритмам SIFT, PolyPhen2 и MutationTaster, является крайне патогенной. Более того, она расположена в локусе ДНК с высокой консервативностью, оцененной как для общей группы позвоночных, так и отдельно для подгрупп плацентарных и приматов. Клиническое значение данной мутации неизвестно. Ранее в том же образце (Pat35, здесь и далее обозначения образцов совпадают с приведенными в публикации [13]) были обнаружены две потенциально драйверные мутации в генах SDHD и RET [13].

Мутация NM_002470: p. Thr442Ile/c.1325C>T (rs769788909, chr17: 10547753) обнаружена в одном исследуемом образце. Она редко встречается в популяции (A=0,00003 по данным ExAC). Мутация не приводит к смене заряда аминокислоты и по данным предсказательных ресурсов SIFT, MutationTaster и PolyPhen2 не является патогенной, также она расположена в локусе ДНК с низкой консервативностью среди позвоночных. Клиническое значение данной мутации неизвестно. Ранее в том же образце (Pat09) обнаружена потенциально драйверная мутация в гене ARNT [13].

Мутация NM_002470: p. Ala1003Val/c.3008C>T (rs34088014, chr17: 10542709) обнаружена в двух образцах каротидных параганглиом (Pat1 и Pat24). Она встречается в популяции с частотой 2% среди здоровых индивидов по данным ExAC и 1000 Genomes Project. По данным ClinVar эта мутация является предположительно непатогенной. В базе данных UniProt она описана как не оказывающая влияние на структуру белка (не меняет заряд, но меняет размер гидрофобного радикала). По данным предсказательных алгоритмов SIFT и PolyPhen2 этот вариант также является непатогенным в отличие от MutationTaster, который оценивает данную мутацию как патогенную. Также она располагается у позвоночных в высококонсервативном участке ДНК.

Мутация NM_002470: p. Ala1752Thr/c.5254G>A (rs34393601, chr17: 10534960) обнаружена в трех исследуемых образцах (Pat01, Pat08 и Pat24). Данная вариация приводит к смене алифатического радикала аминокислоты на ароматический (при этом оба являются гидрофобными). По данным предсказательных алгоритмов SIFT и MutationTaster эта мутация является патогенной, однако PolyPhen2 предсказывает ее как непатогенную. В базе данных ClinVar данная мутация описана как предположительно непатогенная и встречается при артрогрипозах.

Ранее при анализе образцов Pat01 и Pat24 показано отсутствие потенциально драйверных мутаций в основных 42 генах, ассоциированных с патогенезом параганглиом [13]. Таким образом, выявленные две потенциально патогенные мутации в гене MYH3 могут оказаться драйверными для данных образцов. Эти мутации по отдельности имеют невысокую степень патогенности, однако их кумулятивный эффект может привести к развитию заболевания. В образце Pat08 ранее также обнаружена потенциально драйверная мутация в гене SDHD [13].

Мутация NM_002470: p. Ala1604Thr/c.4810G>A (rs201488879, chr17: 10535939) обнаружена в одном образце каротидных параганглиом (Pat44). Она встречается в популяции здоровых людей с частотой 0,01%, согласно базе данных ExAC, при этом не наблюдается в гомозиготном состоянии. Данная мутация также приводит к смене алифатического радикала аминокислоты на ароматический и по данным предсказательных ресурсов SIFT и MutationTaster является предположительно патогенной. Вариация расположена в нуклеотидной позиции с высокой консервативностью среди приматов и плацентарных (PC46w pr=0,994 и PC46w pl=1,0 соответственно). Однако для группы позвоночных данная нуклеотидная позиция не является высококонсервативной (PC100w vr=0,414). Следует отметить, что по данным, опубликованным нами ранее [13], в этом образце также отсутствуют возможные драйверные мутации в 42 генах, наиболее часто связанных с образованием параганглиом. Это позволяет предположить, что в данном случае драйвером может являться именно мутация в гене MYH3.

Мутация NM_002470: p. Ala1198Thr/c.3592G>A (rs61735358, chr17: 10541497) обнаружена в одном исследуемом образце (Pat18). По данным базы здоровых индивидов ExAC эта вариация является редкой и встречается с частотой 0,68%, более того в гомозиготном состоянии встречается всего у 5 индивидов. В базе данных ClinVar она описана как непатогенная, не приводит к смене заряда аминокислоты и встречается при нескольких вариантах артрогрипозов (синдром Фримена–Шелдона). По данным сервисов SIFT и PolyPhen2 эта мутация является предположительно непатогенной. Более того, она находится в локусе с низкой консервативностью среди приматов, однако для выборки из 100 видов позвоночных данная позиция расценивается как высококонсервативная. Предсказательный алгоритм MutationTaster оценивает данную мутацию как патогенную.

Мутация NM_002470: p. Met798Val/c.2392A>G (rs746986821, chr17: 10543684) обнаружена в том же образце каротидных параганглиом (Pat18), не приводит к смене заряда аминокислоты, но меняет серосодержащий метионин на алифатический гидрофобный радикал. Она не описана в базах данных COSMIC и ClinVar и встречается с частотой 0,0008% среди здоровых индивидов по данным базы ExAC. По результатам предсказательного алгоритма SIFT она является патогенной, однако PolyPhen2 и MutationTaster предсказывают ее как непатогенную. Ранее при анализе образца Pat18 показано отсутствие потенциально драйверных мутаций в основных 42 генах, ассоциированных с патогенезом параганглиом [13]. Таким образом, две выявленные потенциально патогенные мутации в гене MYH3, по-видимому, могут быть драйверными для данного образца.

Мутация NM_002470: p. Ser1240Leu/c.3719C>T (rs551363957, chr17: 10541370) обнаружена в одном исследуемом образце (Pat46). Она встречается в базе данных здоровых индивидов ExAC с частотой 0,03% и в гомозиготном состоянии не обнаружена. В базе данных соматических мутаций COSMIC эта замена не представлена, она меняет полярный радикал аминокислоты на алифатический, что может влиять на структуру домена белка. По данным предсказательных алгоритмов SIFT и MutationTaster мутация является патогенной, однако PolyPhen2 описывает ее как непатогенную. Стоит отметить, что данная мутация расположена в позиции ДНК с высокой консервативностью среди 46 видов плацентарных, при этом среди 46 видов приматов, а также 100 видов позвоночных данная позиция не расценивается как высококонсервативная. Ранее в том же образце (Pat46) обнаружена потенциально драйверная мутация в гене SDHB [13].

В настоящее время наиболее эффективным в поисках молекулярных маркеров является так называемый омиксный подход, включающий анализ транскриптомых, экзомных или протеомных данных. В сочетании с разными биоинформатическими методами, в частности алгоритмом xseq, можно получить результаты, важные для клинической практики и фундаментальной науки. Ранее выявлены потенциально драйверные мутации в 42 генах, ассоциированных с параганглиомами. Однако в 20 (38%) из 52 исследованных образцов не обнаружено мутаций в этих генах. Возможно, в данных опухолях малигнизация была инициирована другими молекулярными механизмами, однако более вероятно, что эти образцы несут драйверные мутации в других еще не описанных ранее генах. Поэтому чрезвычайно важно искать новые гены, вовлеченные в развитие каротидных параганглиом и дополнительно их исследовать.

При анализе данных высокопроизводительного секвенирования экзома и транскриптома каротидных параганглиом идентифицирован ген MYH3, который с большой вероятностью вовлечен в их формирование и развитие. Полученные результаты вносят важный вклад в понимание молекулярного патогенеза развития этого заболевания, так как мутации, влияющие на уровень экспрессии гена, играют ключевую роль в изменении нормальных клеточных процессов, что приводит к развитию опухоли.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17−75−20105).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.В.С., А.П.П., М.В.К., А.В.К.

Сбор и обработка материала — А.В.С., С.Л.Х., Д.В.К., Г. С.Р., А.Л.Г., П.А.Н., А.В.К.

Статистическая обработка — Е.Н.Л., С.Л.Х., О.А.С.

Написание текста — А.В.С., А.В.К., С.Л.Х.

Редактирование — Е.Н.Л., Д.В.К., А.Л.Г., М.В.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Лукьянова Елена Николаевна — e-mail: lukianovaelena@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-3566-5873;

Снежкина Анастасия Владимировна — к.б.н.; e-mail: leftger@rambler.ru; https://orcid.org/0000-0002-4421-4364;

Харитонов Сергей Леонидович — e-mail: sergey050894@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-2908-0051;

Калинин Дмитрий Валерьевич — к.м.н.; e-mail: dmitry.v.kalinin@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-6237-9481;

Степанов Олег Алексеевич — e-mail: ollegstepanov@gmail.com; https://orcid.org/0000-001-6129-6499;

Размахаев Георгий Сергеевич — e-mail: razmahaev@yandex.ru; https://orcid.org/0000-00002-3979-8940;

Головюк Александр Леонидович — к.м.н.; e-mail: algolovyuk@inbox.ru; https://orcid.org/0000-0001-6830-7832;

Никифорович Петр Алексеевич — e-mail: nikif1991@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-4031-5050;

Поляков Андрей Павлович — д.м.н.; e-mail: appolyakov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-2095-5931;

Волченко Надежда Николаевна — д.м.н., проф.; e-mail: mnioi_morphology@mail.ru; https://orcid.org/0000-00003-0421-4172;

Киселева Марина Викторовна — д.м.н.; e-mail: kismarvic@mail.ru; https://orcid.org/ 0000-0001-8464-1726;

Андрей Дмитриевич — д.м.н., акад. РАН; e-mail: kaprin@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-8784-8415;

Кудрявцева Анна Викторовна — e-mail: rhizamoeba@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-3722-8207

Лукьянова Е.Н., Снежкина А.В., Харитонов С.Л., Калинин Д.В., Степанов О.А., Размахаев Г.С., Головюк А.Л., Никифорович П.А., Поляков А.П., Волченко Н.Н., Киселева М.В., Каприн А.Д., Кудрявцева А.В. Роль гена MYH3 в патогенезе каротидных параганглиом. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2019;8(2):94-99. https://doi.org/10.17116/onkolog2019802194