Тестовый режим

Новые возможности в диагностике коронавирусной инфекции

Вопреки ожиданиям экспертов коронавирусная инфекция, вызванная SARS-CoV-2, по-прежнему набирает обороты. Все предпринимаемые меры защиты не позволяют на сегодняшний день говорить о затухании инфекции. Связано ли это с мутациями вируса, особенностями иммунитета или с недостаточным охватом вакцинированием – пока однозначно ответить никто не может.

В соответствии с этими тенденциями наблюдается изменение структуры запросов на рынке лабораторной диагностики. Уходит в область рутинных исследований и на второй план ПЦР-тестирование для выявления COVID-19, и на фоне вакцинации растет спрос на количественные тесты на антитела, определение нейтрализующих антител и исследование Т-клеточного иммунитета.

Эти тесты в первую очередь отвечают на вопрос об индивидуальной эффективности проведенной вакцинации или о необходимости вакцинации тех, кто переболел или, несмотря на наличие контактов с заболевшими, так и не заболел. Вакцинированным ранее с помощью этих тестов можно получить информацию о том, когда делать повторную вакцинацию и будет ли она эффективна с учетом выявления новых мутантных штаммов коронавируса SARS-CoV-2.

Что и как

Для того, чтобы разобраться в этих вопросах, необходимо понимать, как устроен сам вирус и как формируется иммунный ответ. Вирус SARS-CoV-2 принадлежит к роду Betacoronavirus (подрод Sarbecovirus) семейства Coronaviridae. Это оболочечный вирус с положительно направленной одноцепочечной молекулой рибонуклеиновой кислоты (РНК). Геном SARS-CoV-2 кодирует неструктурные белки, четыре структурных белка – спайковый (S), оболочечный (E), мембранный (M), нуклеокапсидный (N), а также ряд предполагаемых вспомогательных белков. На поверхности вириона возбудителя инфекции COVID-19 – коронавируса SARS-CoV-2 – локализован структурный белок spike («шпилька», шиповидный белок), который играет ключевую роль во взаимодействии вируса с клеткой человека в процессе инфицирования последней. На субъединице S1 белка spike расположен рецептор-связывающий домен (RBD, receptor-binding domain), который имеет сродство к трансмембранному белку человека, называемому ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2, angiotensin-converting enzyme 2). Данный белок локализован в мембране клеток различных тканей человека, в том числе, пневмоцитов, энтероцитов тонкого кишечника, эндотелиальных клеток артерий и вен, гладкомышечных клеток, а также обнаруживается в клетках коры головного мозга, полосатого тела, гипоталамуса и ствола головного мозга. Спайковый белок SARS-CoV-2 и его рецептор-связывающий домен (RBD) являются критической мишенью для естественного и индуцированного вакциной иммунитета. Таким образом, изменение гена, кодирующего спайковый белок, потенциально может повлиять на свойства вакцины, естественный иммунитет и эффективность терапии с применением моноклональных антител.

В процессе репликации вирусов, особенно РНК-вирусов, таких как SARS-CoV-2, в их геноме происходят изменения (мутации). Если произошедшая мутация не имеет эволюционных дефектов, она может закрепиться в популяциях вируса. Скорость эволюционных изменений в SARS-CoV-2 в настоящее время оценивается как 1000 замен на сайт в год на нуклеотидном уровне. Это соответствует примерно одной замене в геноме каждые две недели. Изучение эволюции SARS-CoV-2 и оперативное выявление замен, вставок или делеций, которые могут повлиять на свойства вируса (фенотипические изменения), является важным инструментом эпидемического мониторинга. Одним из наиболее очевидных результатов такой работы является обнаружение мутаций, которые коррелируют с изменением трансмиссивности и/или патогенности вируса или могут снизить эффективность медицинских контрмер (лечебно-диагностических средств и вакцин). Мониторинг мутаций вируса может помочь отследить распространение вируса и способствовать формированию более полного представления о потенциальных путях и динамике передачи инфекции. В приоритетном порядке мутации вируса SARS-CoV-2 могут возникать в следующих ситуациях:

• развитие инфекции у лиц, которые ранее вакцинированы и демонстрировали адекватный иммунный ответ;

• наличие высокого риска, например, в условиях тесного контакта людей с большим числом животных, восприимчивых к SARS-CoV-2, или при длительном выделении вируса у пациентов с ослабленным иммунитетом, особенно получающих антитела против SARS-CoV-2;

• неожиданное повышение или иное изменение трансмиссивности и/или вирулентности SARS-CoV-2;

• подозрение на изменение эффективности диагностических тестов (таких как тесты на антитела или на антиген, молекулярные анализы) или методов лечения.

Мониторинг мутаций вируса поможет отследить распространение вируса и получить более полное представление о способах и динамике передачи инфекции

Эпидемиологический мониторинг мутаций вируса непрерывно ведется профильными научными организациями для своевременного внесения изменений в состав вакцин при накоплении в популяции определенных мутаций. Но и в рутинной практике обычного лечебного учреждения тоже можно воспользоваться этим механизмом. Медицинские лаборатории сейчас предлагают коммерческое ПЦР-исследование для пациентов с коронавирусной инфекцией «Выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2 генетических линий особого эпидемиологического значения: британский штамм (B.1.1.7), южноафриканский штамм (B.1.351) и бразильский штамм (P.1) (генотипирование)».

Данное исследование может быть информативным в следующих ситуациях:

1. Оценка случаев повторного заражения или «недолеченности» предыдущей инфекции при условии, что генотипирование проводилось при первичной диагностике SARS-Cov-2.

2. Для обследования инфицированных SARS-CoV-2 пациентов, которые ранее были вакцинированы.

3. Проведение оценки распространения коронавирусной инфекции внутри закрытых коллективов.

4. Контроль распространения внутрибольничных инфекций.

Оперативное выявление замен, вставок или делеций, которые могут повлиять на свойства вируса или могут снизить эффективность медицинских мероприятий, позволяет своевременно предупреждать распространение вируса.

Эффективность иммунохимических методов исследования (определение антител IgA, IgM, IgG) зависит от стадии инфекционного процесса, состояния иммунной системы пациента, а также от иммунохимических характеристик. Сейчас на территории Российской Федерации зарегистрирован как минимум 51 набор для выявления иммуноглобулинов к SARS-CoV-2. Для проведения исследования должны применяться только зарегистрированные в России тест-системы, с перечнем которых можно ознакомиться в Государственном реестре медицинских изделий.

Фазы инфекционного процесса

Определение уровня антител в диагностике COVID-19 позволяет определить различные фазы инфекционного процесса (об этом подробно писали в предыдущей статье), дополнить клинические, инструментальные и лабораторные методы диагностики COVID-19. Уровень антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 коррелирует со степенью тяжести заболевания (чем сильнее болел человек, тем выше у него уровень антител). Определение уровня IgG в высоких титрах через 4 недели после вакцинации позволяет подтвердить наличие поствакцинального иммунитета (Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19), версия 11 от 07.05.2021 г.).

Для широкого ряда вакцин против COVID-19 применяются стратегии выработки иммунного ответа на шиповидный белок и домен RBD субъединицы S1. При инфицировании вирионом SARS-CoV-2 в клетке образуется распознающий комплекс между RBD и ACE2. В случае, если такой комплекс не сформировался, клетка не будет инфицирована. Поэтому антитела, которые связывают RBD способом, препятствующим формированию его комплекса с ACE2, нарушают инфицирующую функцию SARS-CoV-2 и, таким образом, являются вируснейтрализующими (то есть такими антителами, которые сами по себе ингибируют репликацию вируса в реакции нейтрализации на культуре клеток in vitro в отсутствие других компонентов иммунной системы) и обеспечивают тот тип протективного иммунитета, который защищает клетки от инфекции. Более 80% вируснейтрализующих антител направлены к RBD S-белка SARS-CoV-2. Важность определения антител к RBD с целью оценки эффективности иммунитета к SARS-CoV-2 и его протективных свойств нашла отражение в действующих клинических рекомендациях. При оценке напряженности поствакцинального протективного иммунитета методом ИФА рекомендуется определение антител к рецептор-связывающему домену (анти-RBD антител). Соответственно, для контроля за поствакцинальным иммунитетом должны применяться наборы, определяющие антитела класса IgG к S-белку коронавируса SARS-CoV-2. Не все из зарегистрированных наборов на выявление антител IgG коронавируса SARS-CoV-2 в качестве мишени определяют шиповидный белок и домен RBD субъединицы S1. Часть наборов направлена на выявление антител только к N-белкам (нуклеокапсидный белок), другая часть – смеси из N-белка, S-белка и домена RBD субъединицы S1. Примером такого теста со смешанным определением белков могут служить наборы производства Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics (Китай), получившие широкое применение в государственной структуре ОМС Московских поликлиник и больниц. Тест показал высокую чувствительность в выявлении переболевших коронавирусной инфекцией, но отличить переболевших от вакцинированных он не может. Для этого понадобится раздельное определение антител IgG к N-белку и S-белку.

Контроль антител

Определение антител IgG к N-белкам в принципе не подходит для контроля формирования иммунного ответа после вакцинации. Эти антитела выявляются только после перенесенного заболевания и со временем исчезают. Интересное исследование опубликовано в журнале The Lancet – EClinicalMedicine. Дэвид Альфего и группа ученых Labcorp проанализировали результаты 39 086 индивидуальных тестов на выявление антител, защищающих от «шипа» и нуклеокапсидного белка вируса SARS-CoV-2. В их анализ вошли образцы, взятые в период с марта 2020 года по январь 2021 года. Титр антител IgG к S- и N-белкам SARS-CoV-2 следовал линейной тенденции, достигая приблизительно 90% позитивности через 21 день после инфицирования. В дальнейшем уровень антител к N-белку снижался более быстрыми темпами, сократившись до 68,2% через 293 дня, в то время как серопозитивность к S-антителам сохранялась на уровне 87,8% через 300 дней. Возраст и пол также были значимыми факторами в прогнозировании серопозитивности, причем у лиц моложе 65 лет серопозитивность была более устойчивой.

При разнообразии тестов (см. таблицу) отследить корректно в динамике количество антител у переболевших или вакцинированных можно только с использованием количественного теста для определения антител IgG к S-белку SARS-CoV-2. С недавнего времени на лабораторном рынке появились тесты, которые удовлетворяют этому требованию.

Характеристика основных диагностических тестов

Область детекции антител	Для чего используется исследование
Поверхностные гликопротеины – spike протеины (S белки шипа). Субъединицы S1 и S2 могут использоваться индивидуально или в комбинации в качестве антигенов для серологического тестирования. Рецептор, связывающий домен, RBD, представляет собой часть субъединицы S1 белка	1. Контроль иммунитета после вакцинации. Не подходит для контроля иммунитета после применения вакцины «ЭпиВакКорона» производства ГНЦ «Вектор». 2. Диагностика перенесенной коронавирусной инфекции. 3. Дифференциальная диагностика ОРВИ и инфекции COVID-19 в стадии выздоровления.
Комплекс из spike протеинов, RBD и N-белок	1. Контроль иммунитета после вакцинации. Не подходит для контроля иммунитета после применения вакцины «ЭпиВакКорона» производства ГНЦ «Вектор». 2. Диагностика недавно перенесенной коронавирусной инфекции. 3. Дифференциальная диагностика ОРВИ и инфекции COVID-19 в стадии выздоровления.
Нуклеокапсидный белок (N-белок)	1. Диагностика недавно перенесенной коронавирусной инфекции у пациентов без симптомов или с отрицательным результатом исследования мазков из рото- и носоглотки на РНК SARS-CoV-2. 2. Дифференциальная диагностика ОРВИ и инфекции COVID-19.

Формулировка «количественный тест» означает, что тест-система стандартизована относительно Международного стандарта ВОЗ (код NIBSC20-136)

Формулировка «количественный тест» означает, что тест-система стандартизована относительно Международного стандарта ВОЗ (иммуноглобулин против SARS-CoV-2 (человека), код NIBSC20–136). В результате такой стандартизации выводится условное математическое соотношение единицы производителя теста с единицей ВОЗ (единица связывания антител на мл – BAU/мл). Это количественное соотношение с Международным стандартом ВОЗ может помочь в стандартизации различных производителей тест-систем для серологической диагностики SARS-CoV-2, так как приведет к единым единицам измерения и облегчит текущие исследования иммунного статуса.

Иммунный ответ

Напряженность иммунитета против конкретной инфекции и его поддержание в течение времени исследуется в основном двумя группами методов: серологическим (оценивается гуморальный иммунный ответ) и иммунологическим (оценивается Т-клеточный иммунитет). У методов определения уровня антител (серологических), несмотря на их массовость и доступность, есть несколько недостатков, снижающих их прогностическую ценность применительно к COVID-19, а именно, отсутствие или низкий уровень специфических антител еще не говорит об отсутствующей или слабой иммунной защите от COVID-19.

Для широко применяемых вакцин против COVID-19 используют стратегии выработки иммунного ответа на шиповидный белок и домен RBD субъединицы S1

При попадании в организм человека вируса SARS-Cov-2 начинают вырабатываться антитела. Но бывают случаи, когда этого не происходит. Иммунный ответ формируется по другой схеме – с участием T-лимфоцитов (T-клеток).

Российская компания «Генериум» разработала тест для «Количественной оценки T-клеточного ответа с использованием теста Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT) на выброс интерферона-гамма (IGRA)». «Тигра-Тест SARS-Cov-2» – тест in vitro, направлен на выявление в крови активных Т-лимфоцитов (Т-клеток), специфически отвечающих на антигены вируса SARS-Cov-2, что позволяет дать адекватную оценку силе и продолжительности иммунного ответа на вирус SARS-CoV-2. В качестве антигенов используют 2 панели:

1. Пептиды S-белка (spike).

2. Пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7a.

Положительный результат теста может потенциально свидетельствовать о перенесенной или текущей инфекции COVID-19, не обязательно симптоматической, и о сформировавшемся T-клеточном иммунитете к вирусу SARS-CoV-2. Опубликованы данные о наличии выраженного T-клеточного ответа даже у серонегативных индивидуумов, которые подвергались частым контактам с пациентами с COVID-19, но тем не менее не заболели. Положительный результат только к пептидам S-белка свидетельствует о сформировавшемся T-клеточном иммунитете после вакцинации препаратами, содержащими в качестве антигена спайк S-белок SARS-CoV-2, но не другие его антигены (в случае, если такая вакцинация имела место). Необходимы дальнейшие исследования для определения, насколько данный T-клеточный иммунитет является защитным. Предлагаемый анализ подходит для всех пациентов вне зависимости от их возраста, пола, иммунного статуса, терапии, поскольку позволяет определить биомаркеры иммунной защиты от COVID-19. Но данное исследование не имеет регистрационного удостоверения как медицинская услуга и может быть применено только для исследовательских целей.

В перспективе ожидается появление новых тестов для определения нейтрализующих антител к коронавирусу SARS-CoV-2 человека и индекса авидности.