Момент истины

Эпоха COVID-19 и виды лабораторных исследований

В 2020 году разгорелась пандемия новой коронавирусной инфекции, что не могло не отразиться на рынке лабораторных услуг, и уже в конце года в России зарегистрировано огромное количество различных тест-систем для диагностики коронавируса SARS-CoV-2. Все эти тесты можно разделить на две большие группы. Первая группа тестов направлена на выявление самого вируса, а вторая – на косвенное определение того, был ли у человека контакт с новой коронавирусной инфекцией.

Метод МАНК

Для подтверждения инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, рекомендуют проводить обнаружение генетического материала (РНК) вируса методами амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Наиболее широкое применение нашел метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ) в режиме реального времени. При работе с ПЦР время выявления РНК вируса от момента поступления в лабораторию до выдачи результата составляет до 6 часов. Аналитическая чувствительность этого метода самая высокая – 1000 копий/мл образца.

При необходимости быстрого тестирования на месте (в аэропорту или перед госпитализацией) широкое применение получили мини-лаборатории (чемоданчики). Чувствительность этого метода самая низкая – всего 10000 копий/мл. Но этого достаточно для выявления носителей с высокой вирусной нагрузкой и большим риском заражения окружающих. В данном случае тестирование проводят также разновидностью МАНК – методом изотермической амплификации в режиме реального времени. Это позволяет за 2 часа выполнить тестирование биологического материала (мазки из рото- и носоглотки) в полностью автоматизированном режиме и интегрировать процессы обработки проб с экстракцией РНК, амплификацией и выдачей заключения.

Когда +, когда –

Для диагностики вируса методом МАНК используют разные виды биологического материала: отделяемое из носо- и ротоглотки, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж и аутопсийный материал. В разных видах биологического материала содержится разное количество вируса. Самое высокое диагностическое значение имеет выявление вируса в бронхоальвеолярном лаваже.

В случае получения первичноположительного результата методом МАНК лаборатории обязаны отправить биоматериал на подтверждение результата в Роспотребнадзор или, в случае наличия у лаборатории разрешения от Роспотребнадзора на самостоятельное подтверждения результатов на своей базе, провести повторное исследование биоматериала на тест-системе другого производителя с другой областью амплификации. Разрешение выдается лабораториям, у которых положительные пробы стабильно подтверждаются в Роспотребнадзоре в течение 10 дней не менее чем в 85%. При этом лаборатории должны самостоятельно подтверждать первичный положительный результат с использованием другой тест-системы. Дополнительно лаборатории один раз в месяц отправляют часть положительных проб на подтверждение в Роспотребнадзор. Это третья ступень проверки, которая гарантирует сохранение высокого качества проведения исследований на базе частных лабораторий.

К сожалению, ложноотрицательные результаты пациент может получить в случаях, которые не зависят от аналитического этапа лаборатории. Иными словами, если в транспортную среду попало недостаточное количество генетического материала вируса, то результат будет отрицательным. Так как большинство тест-систем на рынке могут детектировать РНК коронавируса от 1000 копий/мл, то меньшее содержание в биологическом образце тест-система просто «не увидит». Что может приводить к снижению вирусной нагрузки образца? Как правило, нарушения в подготовке пациента к исследованию и процедуре взятия биоматериала. Но также отрицательный результат пациент может получить в случае, если репликация вируса происходит в нижних дыхательных путях, а биоматериал забирается из верхних.

Доступно большое количество молекулярных тестов на определение вируса SARS-CoV-2, обладающих удовлетворительными рабочими характеристиками, а также высокой чувствительностью и специфичностью. Таким образом, при условии надлежащего выполнения этих тестов и соблюдения стандартов отбора проб, транспортировки материала и ресурсной оснащенности лабораторий риск получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов МАНК низкий.

Требования, предъявляемые к инфраструктуре и биобезопасности лабораторий, выполняющих диагностику с привлечением молекулярных методов, высоки.

Помимо МАНК для определения вируса могут использоваться иммунохимические тесты для прямого определения белковых антигенов вируса, в том числе лабораторные (например, методом ИФА) и диагностические экспресс-тесты (ДЭТ). Применение диагностических экспресс-тестов на определение вирусных белков может ускорить и упростить выявление активной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, но из-за невысокой специфичности этих методов положительные результаты требуется подтвердить методом ПЦР.

Показатель наличия антител

К косвенным методам диагностики COVID-19 у пациента относят обнаружение антител в крови. Но у данного метода только вспомогательное диагностическое значение (например, когда ПЦР-тест отрицательный, но при этом у пациента наблюдается клиническая картина коронавирусной инфекции). Антитела позволяют определить, встречался ли человек с вирусом ранее, то есть оценить гуморальный иммунитет к коронавирусу. Положительный результат серологического исследования свидетельствует о факте перенесенной инфекции, в то время как отрицательный тест на определение антител не позволяет исключить активной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2.

Существующие тест-системы определяют антитела разных классов (IgA, IgM, IgG) и к разным белкам вируса (нуклеокапсиду N и S-белку шипа вируса). Исследование проводят с использованием сыворотки пациентов. Поэтому врачам важно знать, что и когда лучше назначать пациенту из этих исследований.

Антитела класса A (IgA) начинают формироваться примерно со 2-го дня заболевания, достигают пика через 2 недели, но не сохраняются долго в крови. Антитела класса M (IgM) начинают выявляться примерно на 7-е сутки от заражения, достигают пика через неделю и могут длительно определяться в периферическом кровеносном русле. Примерно со 2–3-й недели или ранее начинают определяться антитела класса G (IgG).

Почему исследуют антитела IgG к разным белкам? Во-первых, для определения поствакцинального иммунитета подойдут только тест-системы, которые определяют антитела к S-белкам коронавируса (S1, S2 и RBD комплексу S1-белка). Во-вторых, у большинства людей, которые переболели коронавирусной инфекцией, будут циркулировать антитела к нуклеокапсиду N и S-белку, но не у всех людей образуется 2 вида антител. Поэтому для ретроспективной диагностики лучше проверять антитела сразу к двум белкам.

Кроме того, на сегодняшний день ценной является информация о нейтрализующих антителах. Так, согласно исследованиям зарубежных коллег, среди пациентов с положительными антителами к RBD комплексу S1-белка выявлена нейтрализующая способность этих антител в 86% случаев. А у лиц, имеющих положительные антитела на N-белок, только в 74% антитела проявляли нейтрализующую способность. Поэтому исследовать только антитела IgG к N-белку для определения потенциального иммунитета против COVID-19 сомнительно.

Методы диагностики SARS-CoV-2*

Параметр	МАНК	ИФА
Что определяет	РНК вируса	Антитела: • IgA • IgM • IgG
Биологический материал	• Назофарингеальные мазки • Бронхоальвеолярный лаваж • Мокрота	Сыворотка крови
Интервал обнаружения инфекции	От 24 часов до 42 дней с момента заболевания. Диапазон выделения вирусной РНК вариабелен и зависит от тяжести заболевания	• Антитела IgA – с 4–5-го дня заболевания и начинают снижаться к 40-му дню • Антитела IgM – с 5–7-го дня заболевания, после 4 недель снижаются, исчезают к 7-й неделе заболевания • Антитела IgG – появляются после 7-го дня заболевания, остаются надолго
В каком периоде заболевания	Всем пациентам в остром периоде	Пациенты с легкой и средней степенью заболевания (время обращения – 2 недели с момента заболевания)
В каких условиях	—	Приемный покой. Стационары. Скрининг для выявления эпидемических очагов заболевания
Факторы, влияющие на результат анализа	Ложноотрицательный результат возможен: • неверный срок отбора проб от начала заболевания • неправильная методика взятия проб • диагностическая чувствительность определения РНК в разном биоматериале: – бронхолегочный лаваж – 93% – мокрота – 72% – мазок из носа/глотки – 63%	Ложноотрицательный результат возможен из-за отбора проб в неверном сроке от начала заболевания

* Sethuraman N, Jeremiah SS, Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 2020;323(22):2249–2251. https://doi.org/10.1001/jama.2020.8259

Как интерпретировать результаты исследования

Одновременное определение в сыворотке крови антител IgG и IgA/IgM к коронавирусу SARS-CoV-2 (положительный результат) чаще всего означает, что пациент недавно перенес инфекцию или в данный момент проходит стадию выздоровления. Обнаружение же только антител IgA/IgM, скорее всего, будет говорить о присутствии инфекции в организме в данное время. Если же определены только IgG, то, по всей вероятности, пациент уже перенес инфекцию.

Ложноположительные результаты могут появиться при наличии в крови пациента «перекрестно реагирующих» антител, сходных по своим иммунохимическим свойствам со специфическими антителами (антитела к другим коронавирусам, ревматоидный фактор).

Как расшифровывать результаты тестов на антитела и вирус?

МАНК на коронавирус	Тестирование на антитела		Интерпретация
	IgM	IgG
–	‒	‒	Контакта с вирусом не было
‒	+	‒	Контакт с вирусом состоялся недавно, начальная стадия или бессимптомное течение
+	+	‒
+	+	+	Активная стадия
‒	+	+	• Период выздоровления • От момента контакта могло пройти уже 2–3 недели при бессимптомном течении
‒	‒	+	• Стадия выздоровления • Перенесенное в прошлом заболевание • От момента контакта с вирусом могло пройти больше 3 недель при бессимптомном течении

Тесты – 3 вида: в чем различия?

Чем отличаются друг от друга количественные, полуколичественные и качественные виды исследований на определение антител к коронавирусу SARS-CoV-2?

В лабораториях результаты исследования дифференцируют на качественные и количественные. Существует еще один вариант – полуколичественные тесты. Но формат оценки результата в полуколичественных тестах может быть разный – либо в плюсах (+++), либо в цифрах. Поэтому полуколичественные тесты можно отнести сразу к двум группам. При этом в группу качественных тестов будут попадать исследования, результат которых оценивается в плюсах. Например, оценка в виде «+» говорит о положительном результате, но малом количестве исследуемого вещества или антител. Соответственно, чем больше плюсов в результате, тем больше концентрация/количество аналита. А полуколичественные результаты, которые выдаются в виде цифр, можно отнести к группе количественных тестов.

Но полуколичественные тесты, оцениваемые «в плюсах», практически ушли с рынка лабораторных услуг, поэтому на сегодняшний день можно разделить тесты на 3 вида – качественные, полуколичественные и количественные.

В качественных тестах результат исследования антител получают в формате «обнаружено/не обнаружено», без указания концентрации обнаруженных антител. Оценить в динамике рост антител по таким тест-системам нельзя.

В полуколичественных тестах результат оценивается в лабораторных единицах измерения – оптическая плотность (ОП) или коэффициент позитивности (КП). Данные тесты определяют не количество антител в единице объема сыворотки (например, в мл), а во сколько раз оптическая плотность сыворотки пациента превышает допустимый порог относительно отрицательной контрольной сыворотки. Если вы получили значение 5,2 КП, а нормальные значения меньше 1, то у вас выявлены антитела, и их содержание в 5 раз выше, чем в отрицательной сыворотке. Чем выше уровень КП/ОП, тем больше концентрация антител в пробе.

Полуколичественные тесты могут оцениваться в единицах на миллилитр/литр (Ед/мл), но на сегодняшний день нет международного стандарта определения антител к коронавирусу, поэтому, строго говоря, эти тесты все равно будут относиться к полуколичественным.

В количественных тестах определяется концентрация антител в единице объема – МЕ/мл (международные единицы в миллилитре), и такие тест-системы имеют международный стандарт определения антител. Данные тесты показывают напряженность иммунного ответа к патогенным микроорганизмам (вирусы, бактерии, гельминты, грибы). И чем выше концентрация антител, тем сильнее иммунный ответ на патоген и тем дольше сохраняется иммунологическая память.

На сегодняшний день единый международный «золотой» стандарт для определения антител к коронавирусу SARS-CoV-2 не разработан. Для определения антител производители тестов используют разные белки и единицы измерения. Это приводит к тому, что невозможно сравнить результаты, полученные с применением тестов разных производителей. Более того, не все тесты позволяют сделать однозначные выводы об эффективности серологического ответа на ту или иную вакцину. С МАНК в этом отношении легче, так как есть четкие рекомендации о мишенях области генома, на которую подбирают праймеры, поэтому результаты ПЦР-теста более воспроизводимы и сравнимы между собой.