Генетические аспекты механочувствительности альфапротеобактерий Azospirillum baldaniorum со смешанным жгутикованием

Микроорганизмы способны заселять разнообразные по своим свойствам места обитания, которые характеризуются гетерогенностью и динамичностью физико-химических и механических свойств [1]. Бактериям приходится испытывать различные механовоздействия (например, при нахождении в потоке жидкости или при контакте с биотическими и абиотическими вязкими или плотными поверхностями), на которые они могут отвечать изменениями в подвижности, переходом от свободного плавания к роению или закреплению на субстрате с последующим формированием микроколоний и биопленок [1, 2].

Стимулирующие рост растений бактерии рода Azospirillum, используемые в сельскохозяйственных биотехнологиях, приспособлены к обитанию в разнообразных природных средах и обладают выраженной генетической и фенотипической пластичностью [3]. Так, некоторые азоспириллы, включая Azospirillum baldaniorum Sp245 (ранее Azospirillum brasilense [4]), отвечают на изменения плотности среды обитания небольшими, но статистически значимыми изменениями длины клеток, характера их жгутикования (синтезируют только конститутивный полярный жгутик [Fla] либо индуцибельные латеральные жгутики [Laf]) и образа жизни (плавание, роение или образование колоний и биопленок) [5, 6]. Однако механизмы восприятия механических сигналов и выработка ответа на них у этих и других микроорганизмов изучены мало. Тем не менее есть данные о том, что механосенсорные функции могут выполнять жгутики, первыми вступающие в контакт с микроокружением бактерий [2]. Сравнительный анализ процесса формирования биопленок штамма A. baldaniorum Sp245 и его Fla‾ производных выявил негативное влияние утраты Fla на накопление биомассы в биопленках мутантов, образованных на интерфазе между плотной и жидкой средами, и на стабильность биопленок в условиях гидродинамического сдвига [7]. Восстановление у комплементированных Fla‾ мутантов способности к образованию Fla устранило названные дефекты [6].

Бактериальные жгутики имеют в целом консервативную структуру и состоят из базального тела, крюка и филамента. Базальное тело выполняет функции якоря жгутика в оболочке клетки, мотора и экспортной машины и включает кольцевые белковые комплексы, стержень и систему секреции III типа [1, 2]. Одним из ключевых компонентов системы секреции является белок FlhB. В геноме штамма Sp245 есть два предполагаемых гена flhB, расположенных в хромосоме и плазмиде AZOBR p4 (accession nos. HE577327—HE577333). Нами установлено, что хромосомный ген flhB1 (локус AZOBR_150177) необходим для образования и Fla, и Laf [8]. Обнаружено, что инсерционный flhB1 мутант Sp245.1063 потерял способность к укорочению клеток после их переноса с агаризованной в жидкую среду (и наоборот), а у комплементированного мутанта Sp245.1063 (pRK415—flhB1) эта способность к морфологическому ответу на изменения плотности среды восстановилась [8].

Наша гипотеза заключается в том, что в восприятии изменений механических свойств среды и передаче механосигналов в клетках A. baldaniorum задействованы ассоциированные с клеточной мембраной белки: FlhB (компонент аппарата секреции III типа, расположенного в базальном теле Fla) и предполагаемая мультисенсорная гибридная гистидинкиназа — регулятор ответа (HSHK—RR). Эти белки кодируются смежными кодирующими последовательностями (CDSs) AZOBR_150177 (flhB1) и AZOBR_150176 (HSHK—RR) из хромосомного кластера предполагаемых флагеллярных генов типового штамма A. baldaniorum Sp245; гомологи этих CDSs имеют такое же смежное расположение в геномах ряда других штаммов азоспирилл.

Штаммы бактерий, питательные среды и условия культивирования. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды представлены в табл. 1. Бактерии выращивали в малатно-солевой среде (МСС [12]) или среде Luria—Bertani (LB [13]) при 30 °C. При необходимости в среду вносили антибиотики канамицин (Km, 30 мкг/мл) и тетрациклин (Tc, 25 мкг/мл). Концентрация Бакто агара в плотных средах составляла 20 г/л.

Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе

Планктонные культуры выращивали в жидких средах при интенсивном перемешивании (140 об/мин) и температуре 28 °C на шейкере-инкубаторе Excella E24 («New Brunswick Scientific», США). Каждые 2 ч измеряли ОП₅₉₀ бактериальных культур, проводили фазово-контрастную микроскопию, подготавливали препараты для просвечивающей электронной микроскопии.

Конструирование производных A. baldaniorum с увеличенной дозой CDS AZOBR_150176. С целью выяснения значимости CDS AZOBR_150176 для процессов, определяющих морфологию клеток, жгутикование и поведение бактерий, эту последовательность штамма Sp245 клонировали в экспрессионном векторе pRK415. Для постановки ПЦР использовали прямой (F) 150176HF (CCAAGCTTCGAACGGCTGACCTGGAGT) и обратный (R) 150176ER (GGGAACCGAATTCTGGGCCTATCACG) праймеры, в которые были включены сайты рестрикции HindIII (H) или EcoRI (E). CDS была клонирована за lac промотором плазмиды pRK415. Полученную конструкцию переносили в A. baldaniorum с помощью трехродительского скрещивания (см. табл. 1).

Анализ процесса формирования и микроструктуры биопленок азоспирилл. 18-часовые культуры азоспирилл, выращенные в жидкой среде МСС, разводили стерильной средой до значений ОП₅₉₀=0,05—0,10, вносили в стеклянные пробирки (по 2 мл) и инкубировали в течение 6 сут при 30 °C в стационарных условиях. У азоспирилл к 6-м суткам инкубации стабилизируется относительное количество биомассы биопленок и завершается процесс их формирования [7]. Для оценки относительного количества биомассы в биопленках бактерии окрашивали кристаллическим фиолетовым [14]. Фазово-контрастную и просвечивающую электронную микроскопию биопленок и отдельных клеток выполняли на приборах Leica DM6000 B («Leica-Microsystems», Германия) и Libra 120 («Carl Zeiss», Германия). Подробную информацию о процедурах подготовки препаратов для микроскопии и их анализа можно найти в работе [7].

Статистическая обработка результатов. Выполняли не менее трех независимых экспериментов, как минимум в двух повторностях. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента (доверительные интервалы даны для 95% уровня значимости) и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) (при уровне значимости p≤0,05). Для статистической обработки использовали пакет программ Microsoft Office Excel 2010.

Характеристика динамики изменения длины клеток, характера их жгутикования после перевода бактерий с агаризованной среды в жидкую среду культивирования. В качестве первого шага для получения ответа на вопрос о том, играет ли CDS AZOBR_150176 (HSHK—RR) какую-либо роль в сборке жгутиков и/или в адаптации бактерий к плотности среды, мы увеличили дозу этой последовательности в клетках штаммов Sp245 и Sp245.1063 введением в них плазмиды pRK415-150176. Сравнение роста использованных в работе штаммов A. baldaniorum Sp245, его Fla‾Laf‾ мутанта Sp245.1063 и их производных (см. табл. 1) в жидких средах показывает, что при интенсивном перемешивании их планктонные культуры после 24 ч инкубации находятся в стационарной фазе роста. Время удвоения плотности бактериальных культур составляет 2,5—3 ч. Клетки Sp245 и Sp245(pRK415-150176) суточных культур несут Fla, располагающийся на одном из полюсов клетки, при помощи которого в среднем (86,2±2,4)% бактерий плавают прямолинейно со случайным изменением направления движения со скоростью 29,2±1,9 мкм/с. Клетки Sp245.1063 и Sp245.1063(pRK415-150176) были неподвижны. На агаризованных средах все штаммы формируют колонии за 48 ч культивирования. Бактерии Sp245 и Sp245(pRK415-150176) дополнительно синтезируют многочисленные Laf (фенотип Fla⁺Laf⁺). У клеток мутанта Sp245.1063 и его производного Sp245.1063(pRK415-150176) отсутствуют оба типа жгутиков независимо от условий культивирования.

Исследовано изменение характера жгутикования при переводе Fla⁺Laf⁺ клеток штаммов Sp245 и Sp245(pRK415-150176) с агаризованной среды в жидкую. После 3 ч культивирования в культуре Sp245 26% бактерий сохраняют Fla и Laf, 65% бактерий синтезируют только Fla и у 9% особей жгутики отсутствуют. В случае Sp245(pRK415-150176) 67% клеток имеют Fla и Laf, 26% — только Fla, 7% не синтезируют жгутики. После 6 ч культивирования соотношение (Fla⁺Laf⁺)/(Fla⁺)/(Fla‾) клеток у Sp245(pRK415-150176) становится похожим на показатели, характерные для 3 ч культуры Sp245, — 32% клеток производного имеют Fla и Laf, 61% — несут только Fla, 7% не синтезирую жгутики. У штамма Sp245 через 6 ч соотношение (Fla⁺Laf⁺)/(Fla⁺)/(Fla‾) клеток составляет соответственно 0/92/8%. В 18-часовых (растущая планктонная культура выходит на стационарную фазу роста) и 24-часовых (стационарная фаза роста) культурах у Sp245 93% бактерий синтезируют Fla, у 7% — жгутики отсутствуют, а в случае Sp245(pRK415-150176) — 94% клеток с Fla, 6% особей лишены жгутов. После 48 ч культивирования в планктонных культурах Sp245 и Sp245(pRK415-150176) жгутикование существенно не меняется.

Мы также проанализировали изменение длины интактных клеток при переводе бактерий с агаризованной в жидкую среду. В случае штамма Sp245.1063 длина планктонных клеток на 20% больше, чем у Sp245 и Sp245(pRK415-150176). На плотных средах размер клеток Sp245 и Sp245.1063 не отличается, а длина клеток Sp245(pRK415-150176) на 30% меньше показателей родительского штамма и мутанта. Через 3—6 ч после инокуляции с плотной среды в жидкую культуру размер клеток у всех исследованных штаммов существенно не изменяется. В 18- и 24-часовых планктонных культурах Sp245 длина клеток на 18% меньше по сравнению с показателем, характерным для бактерий этого штамма с агаризованных сред. В случае Sp245(pRK415-150176) и Sp245.1063 при переходе с плотной в жидкую среду изменения размера бактерий не происходит.

Анализ динамики формирования биопленок, изменения длины клеток, характера их жгутикования при переходе планктонных клеток к биопленочному существованию (биопленочная популяция). Процесс формирования биопленок исследованными штаммами на разделе жидкость и твердая гидрофильная поверхность включает последовательно адсорбцию и адгезию клеток (2—3-и сутки), прирост и стабилизацию биомассы биопленки (6—7-е сутки, зрелые биопленки). На этапах адсорбции и адгезии у всех исследованных штаммов на твердой поверхности фиксируется примерно равное количество бактериальной биомассы. Однако в зрелых биопленках в случае Sp245.1063 и Sp245.1063(pRK415-150176) показатели биомассы на 40—50% уступают величинам, характерным для Sp245 и Sp245(pRK415-150176).

Мы определили длину и ширину «фиксированных» бактерий в биопленках на этапах их адсорбции/адгезии (2-суточные биопленки) и зрелых биопленках (7-суточное культивирование) и сравнили с размером клеток из планктонных культур и бактерий с агаризованной среды (табл. 2). При переходе планктонных клеток Sp245 к биопленочному существованию происходит увеличение длины клеток уже на этапе адсорбции/адгезии бактерий до размера, характерного для бактерий этого штамма, выросших на плотной среде культивирования. В свою очередь в биопленках Sp245 значительного увеличения длины и ширины клеток не происходит. Ширина бактерий в биопленках существенно не меняется на всем протяжении культивирования.

Таблица 2. Средний размер клеток штаммов A.baldaniorum

Примечание. Измерения проводили у клеток, фиксированных на подложках для просвечивающей электронной микроскопии; указаны доверительные интервалы на уровне значимости 95%. Результаты однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) длины и ширины клеток представлены соответственно заглавными и строчными буквами; разными буквами обозначены статистически значимые различия между средними. А или а — средние значения с наименьшей величиной.

У бактерий Sp245, перешедших из планктонной культуры к биопленочной (раздел твердая поверхность/жидкая среда), увеличивается длина до размеров, характерных для клеток с плотной агаризованной среды (раздел плотная среда/воздух) (см. табл. 2). Длина клеток из биопленок, планктонных культур и с плотной среды Fla‾Laf‾ flhB1::Omegon-Km мутанта Sp245.1063 равна размеру бактерий Sp245 с плотной агаризованной среды, а в случае Sp245(pRK415-150176) и Sp245.1063(pRK415-150176) этот показатель равен величине особей родительского штамма из жидкой среды (см. табл. 2).

Исследовано изменение характера жгутикования при переходе Fla⁺ клеток штаммов Sp245 и Sp245(pRK415-150176) из планктонной культуры к биопленочному существованию (клетки закреплены на твердой поверхности под слоем жидкой МСС). Необходимо отметить, что ни в данной серии экспериментов (для инокуляции в жидкую среду использовали суточные планктонные культуры), ни в наших ранних работах при использовании просвечивающей электронной микроскопии мы не обнаружили присутствия Laf на клетках биопленок всех исследованных штаммов [6, 7]. В случае, когда для инокуляции в жидкую МСС использовали Fla⁺Laf⁺ клетки с плотной среды, в зрелых биопленках также не удалось обнаружить особей с Laf. Fla присутствовал у клеток Sp245 и Sp245(pRK415-150176) из биопленок на всех этапах формирования биопленочной популяции. Клетки Sp245.1063 и Sp245.1063(pRK415-150176) были лишены Fla или Laf, как и планктонные бактерии.

Подводя итог данного этапа исследований, можно отметить, что при переходе бактерий Sp245 из планктонных культур к формированию биопленок (на разделе твердая поверхность/жидкая среда) у них происходит увеличение длины клеток до размеров, характерных для особей, взятых с агаризованной среды культивирования (раздел плотная среда/воздух). Существенным отличием биопленочных клеток от бактерий, выросших на агаризованной среде, является отсутствие Laf.

Необходимо отметить, что введение векторной плазмиды pRK415 в Sp245 и Sp245.1063 не повлияло на морфологию клеток, подвижность и способность формировать биопленки этими штаммами. Введение pRK415-150176 не привело к восстановлению дефектов в жгутиковании и подвижности мутанта Sp245.1063. Однако увеличение дозы гена HSHK—RR у Sp245 и Sp245.1063 (штаммы Sp245(pRK415-150176) и Sp245.1063(pRK415-150176)) оказывает влияние на способность клеток изменять размер в ответ на модификацию плотности среды. Ранее было обнаружено, что Fla‾Laf‾ flhB1::Omegon-Km мутант Sp245.1063 потерял способность к укорочению клеток, а у мутанта Sp245.1063(pRK415—flhB1) эта способность к морфологическому ответу на изменения в плотности среды восстановилась [8]. В случае Sp245 дополнительная копия CDS AZOBR_150176 влияет на динамику изменения характера жгутикования при переходе Fla⁺Laf⁺ клеток к планктонному образу жизни (фенотип Fla⁺). Таким образом, ассоциированные с клеточной мембраной белки FlhB1 и предполагаемая мультисенсорная гибридная гистидинкиназа—регулятор ответа (HSHK—RR) задействованы в восприятии изменений механических свойств среды и передаче соответствующих механосигналов в клетках A. baldaniorum.

Благодарности

Авторы выражают признательность Центру коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии «Симбиоз» ИБФРМ РАН (Саратов, Россия) за допуск к работе на приборах Leica DM6000 B и Libra 120.

Финансирование работы

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 20-04-00006_а).

Соблюдение этических стандартов

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.