Исследование полиморфизма генов плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза у пациентов с хроническими миелопролиферативными новообразованиями

Классические Ph-негативные хронические миелопролиферативные новообразования (ХМН) характеризуются клональной пролиферацией одной или более клеточной линии миелопоэза с признаками сохраняющейся терминальной дифференцировки и сопровождаются соответствующим изменением показателей периферической крови [1]. В соответствии с классификацией ВОЗ [2] к ХМН относят истинную полицитемию (ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ). Известно, что данные заболевания наиболее часто ассоциированы с наличием соматических мутаций в гене Янус-киназы (JAK2), рецептора тромбопоэтина (MPL) и кальретикулина (CALR). Указанные мутации вызывают активацию сигнального каскада независимо от цитокинов и факторов роста и определяют ведущее звено патогенеза ХМН. Вместе с тем остаются невыясненными молекулярные механизмы, определяющие конкретные фенотипические проявления ХМН: ИП, ЭТ или ПМФ. Одно из возможных объяснений может быть связано с особенностями межклеточного взаимодействия, в том числе обусловленного генетическими полиморфизмами рецепторных молекул. Относительно недавно выявлено, что процесс отщепления сиаловых кислот от рецептора интегринов под влиянием освобожденных из тромбоцитарных гранул нейраминидаз регулирует секрецию тромбопоэтина [3] и экспрессию тромбопоэтиновых рецепторов мегакариобластов [3, 4]. Учитывая, что наличие отдельных полиморфизмов в генах тромбоцитарного и плазменного гемостаза влияет на различные характеристики метаболизма и/или сродства к лигандам рецепторных молекул, можно предполагать их участие в патогенезе ХМН. Вместе с тем только единичные публикации [5] посвящены исследованию данного вопроса.

Целью настоящей работы явилось определение прогностического значения носительства генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов на развитие отдельных нозологических вариантов ХМН.

Обследованы 160 пациентов (89 женщин и 71 мужчина) с диагнозом ХМН, которые поступали на консультативный прием врачей-гематологов в амбулаторно-поликлинические учреждения Красноярска и Красноярскую краевую клиническую больницу. Средний возраст пациентов — 61±13 лет (от 25 до 84 лет). Из них 90 пациентов имели диагноз ИП, 38 — ЭТ и 20 — миелофиброз (МФ), в том числе как ПМФ, так и МФ, развившийся в процессе естественной эволюции ИП или ЭТ.

Контрольную группу составили 142 человека, не имевших ХМН на момент обследования: 55 женщин и 87 мужчин. Средний возраст лиц контрольной группы составил 45±13 лет (от 18 до 87 лет). Все участники исследования подписывали регламентированную форму информированного согласия на оказание медицинской помощи и проведение лабораторного тестирования.

Все отобранные нами из архива лаборатории пробы пациентов тестировались на наличие тромбогенных полиморфизмов в генах протромбина FII (G20210A, rs1799963), фактора FV (G1691A, rs6025), фермента метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR (C677T, rs1801133), а также полиморфизмов в генах тромбоцитарных рецепторов к фибриногену (T1565C, rs5918), фактору Виллебранда GPIBA (C482T, rs6065 и -5T/C rs2243093), коллагену ITGA2 (С807Т, rs1126643), АДФ P2RY12 (Н1/Н2, rs2046934) и Р-селектину SELPIG (G186A rs2228315).

Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили экспресс-методом с использованием реагента «ДНК-экспресс-кровь» (НПО «Литех»). ПЦР проводили в вариантах как с электрофоретической детекцией («SNP-экспресс», НПО «Литех»), так и в режиме реального времени («SNP-экспресс-РВ», «SNP-экспресс-SHOT», НПО Литех) на приборе iCycler iQ5 («BioRad»).

Статистическую оценку проводили при помощи таблиц сопряженности методом расчета параметра χ² с использованием web-калькулятора на сайте ГНЦ РФ ГосНИИ генетика (http://gen-exp.ru/calculator_or.php).

По результатам проведенного генотипирования следует отметить, что распространенность всех исследуемых нами полиморфных генов системы гемостаза в общей группе пациентов с ХМН в целом соответствует данным в группе контроля и Европейской популяции (по данным базы NCBI) [6] (табл. 1).

Вместе с тем при сравнении результатов в группах пациентов с разными фенотипическими вариантами ХМН (ИП, ЭТ, МФ) нами выявлено статистически значимое отличие по распространенности полиморфизма гена тромбоцитарного рецептора фактора Виллебранда C482T между пациентами с диагнозом ИП и ЭТ по мультипликативной (OR=2,91; ДИ: 1,14—7,46; р=0,02) и аддитивной модели (OR=3,33; ДИ: 1,15—9,66; р=0,03). В частности, в группе больных ЭТ чаще встречается вариант CT по сравнению с группой больных И.П. Данный полиморфизм сцеплен с VNTR-полиморфизмом, который определяет различную длину «ножки» рецепторной субъединицы Iba [8]. Более длинная «ножка» обеспечивает более эффективное связывание с лигандом. Известно, что замена C482T локализована в области связывания белкового комплекса GPIb-IX-V с лигандами и оказывает влияние на функциональные свойства рецептора, в том числе на взаимодействие с фактором Виллебранда. Таким образом, аллель T полиморфизма C482T GP1BA приводит к более прочной связи лиганда с рецептором.

Нами также впервые обнаружено, что в группе больных МФ аллель 186A гена SELPLG встречается чаще по сравнению с группой больных ИП. (OR=3,88 ДИ: 1,14—13,25; р=0,02). Известно, что лиганд Р-селектина участвует во взаимодействии тромбоцитов с лейкоцитами и образовании тромбоцит-лейкоцитарных агрегатов. Вероятно, такое взаимодействие обусловливает более выраженную активацию воспалительных процессов в костном мозге, что и способствует развитию фиброза.

Исходя из полученных нами результатов, можно предположить, что у пациентов с ХМН, имеющих полиморфный вариант 482T в гене GP1BA и вариант 186A в гене SELPLG, могут быть также изменены характеристики сродства к межклеточным ферментам катаболизма (нейраминидазам, металлопероксидазам), что может приводить к сдвигам в регуляции тромбопоэтинового сигнала и/или взаимодействия с матриксом костного мозга. Эти сдвиги в свою очередь могут определять особенности патоморфогенеза и клинической картины ХМН.

Мы не смогли подтвердить данные Д.И. Шихбабаевой и соавт. [5] о повышенной частоте обнаружения генотипов CT+ТT полиморфизма C677T в гене MTHFR среди больных ИП по сравнению с контрольной группой (OR=1,2) и варианта ТC полиморфизма T1565C в гене ITGB3 (OR=1,4), что, очевидно, связано с относительно небольшими выборками, этнической структурой, а также различиями в группе пациентов с ИП по показателю длительности заболевания. Расширение выборки исследуемых групп и совмещение баз данных поможет уточнить роль данных полиморфизмов в патогенезе ХМН.

Таким образом, результаты проведенного исследования демонстрируют статистически значимую разницу частоты встречаемости полиморфизма C482T в гене GPIBA в группе пациентов с ЭТ и полиморфизма G186A в гене SELPIG среди пациентов с МФ по сравнению с И.П. Частота встречаемости исследованных полиморфизмов в генах F2, F5, MTHFR и ITGB3 при разных фенотипических вариантах ХМН в нашем исследовании не отличалась от контрольной группы. Вероятные причины обнаруженных различий связаны с рецепторно-обусловленными механизмами регуляции пролиферативной активности клеток мегакариоцитарного ростка, активацией продукции провоспалительных цитокинов лейкоцитами и особенностями взаимодействия с коллагеновым матриксом костного мозга.

Полученные данные позволяют предложить определение полиморфизма отдельных генов тромбоцитарных рецепторов в качестве дополнительных маркеров в диагностике и оценке риска развития различных нозологических вариантов ХМН. Вместе с тем необходимо дальнейшее исследование связи генетических особенностей тромбоцитарных рецепторов с функциональной активностью клеток крови, участвующих в механизмах гемостаза, а также с риском тромбогеморрагических осложнений у больных ХМН.

Благодарности. Авторы статьи выражают благодарность научным сотрудникам Красноярского филиала А.С. Горбенко и М.А. Столяр за помощь в организации работы и выполнении лабораторных исследований.

Данная работа поддержана мероприятием 2.1.6 — приобретением реактивов в рамках программы повышения конкурентоспособности ФГУ ВО СФУ среди ведущих мировых научно-образовательных центров по гранту «дооснащение лабораторий СФУ» для выполнения научных исследований (программа 5/100).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.