Современные биохимические маркеры острой мезентериальной ишемии

ОМИ — острая мезентериальная ишемия

АТФ — аденозинтрифосфат

АФК — активные формы кислорода

mPTP — переходные поры проницаемости митохондрий

КТ — компьютерная томография

Европейское общество сосудистой хирургии (ESVS) определяет острую мезентериальную ишемию (ОМИ) как состояние резкого прекращения артериального брыжеечного кровотока с развитием симптомов, которые могут варьировать по времени начала от минут (при эмболии) до часов (при атеротромбозе) [1]. Острая брыжеечная ишемия считается достаточно редким заболеванием, но, по-видимому, является более частой причиной симптомокомплекса «острого живота», чем аппендицит или разрыв брюшной аорты вследствие аневризмы у пожилых пациентов. Хирургическое лечение без реваскуляризации связано с высокой общей смертностью, доходящей до пугающих 100% при отсутствии своевременной диагностики и хирургического лечения.

Основу жизнедеятельности каждой клетки осуществляет ее энергетический обмен, который состоит из взаимообратных протекающих энергопродуцирующих и энергопотребляющих процессов, что в свою очередь влияет на все остальные клеточные функции. Основным энергетическим субстратом для клеток является аденозинтрифосфат (АТФ). Гипоксия считается типовым патологическим процессом, который характеризуется нарушением снабжения тканей организма кислородом, а также нарушением его утилизации клетками. Вне зависимости от факторов, приводящих к гипоксическому повреждению, основным механизмом губительного действия для клеточных структур является нарушение процессов биологического окисления и, как следствие, внутриклеточного энергетического обмена [2].

Резкое уменьшение выработки АТФ приводит к дисфункции Na+/K+-АТФ-фазы и угнетает процесс формирования мембранных потенциалов. Данный фактор оказывает повреждающее действие на элементы цитоскелета клетки и в результате нарушает функцию ее транспортных систем. Быстрый подъем цитоплазматического pH образует высокую проницаемость мембран лизосом, что в свою очередь приводит к разрушению самих клеточных структур под действием лизосомальных ферментов. Основным звеном патогенеза ишемии являются запуск процессов перекисного окисления липидов, усиление продукции активных форм кислорода и быстрое формирование оксидативного стресса.

Особенностью гипоксии при развитии ишемии кишки является ее многофакторность. С одной стороны, происходит уменьшение кровоснабжения тканей, однако газовый состав крови при этом может находиться в норме. Но наиболее губительно происходит второй, параллельный, процесс внутри клетки — тканевая (гистотоксическая) гипоксия как результат нарушения утилизации кислорода. Данный фактор может быть следствием нарушения физико-химических параметров внутри клетки (pH внутренней среды, электролитный состав, нарушение синтеза ферментов и их токсическое действие) [2].

Нарушение транспорта кислорода внутрь клетки и снижение энергообмена приводят к падению уровня внутриклеточного АТФ и резкому подавлению энергозависимых процессов, что лежит в основе мультисистемности функционально-метаболических нарушений, происходящих при развитии кишечной гипоксии. Гипоксическое повреждение кишечной стенки представляет собой опасное для жизни состояние, включающее повреждение барьера слизистой оболочки, усиливающее бактериальную транслокацию, которая первоначально возникает в кишечнике, а также является триггером синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) и синдрома полиорганной дисфункции (MODS).

Метаболический ацидоз, вызванный повреждением стенки кишечника, возникает не только из-за прерывания кровоснабжения, но и из-за частичного реперфузионного восстановления кровоснабжения, что является не менее серьезным эффектом, который сопровождается массовым образованием активных форм кислорода (АФК) [3]. Накопленные АФК, такие как перекись водорода (H₂O₂) и гидроксильный радикал (OH), модифицируют внутриклеточные молекулы, повреждают клеточные липиды, белки и дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), нарушают гомеостаз кишечного эпителия и в конечном счете индуцируют апоптоз.

Большая часть H₂O₂ вырабатывается в митохондриях, где также вызывает их окислительное повреждение. Нарушение функции и целостности митохондрий, вызванное окислительным повреждением, влияет на окислительно-восстановительную сигнализацию и усиливает клеточный стресс, таким образом усиливает апоптоз и провоцирует развитие некробиотических изменений в клетке.

Ключевым фактором активации апоптоза при нарушении метаболизма митохондрий является выход цитохрома C из пространства между мембранами в цитозоль, что сопровождается набуханием митохондрий [4]. Цитоплазматический цитохром C связывается с APAF (Apoptosis Protease Activating Factor)-1, приводя к процессу олигомеризации APAF-1 и его связыванию с прокаспазой-9. Формирование данного комплекса, обозначаемого апоптосомой, активирует прокаспазу-9, которая в свою очередь приводит к активации уже эффекторные каспазы (прокаспазу-3 и др.). Кроме цитохрома C, митохондрии индуцируют развитие и усиление апоптоза, используя и иные возможные медиаторы: Smac/Diablo, Apoptosis-Inducing Factor, Omi/HtrA2 [4].

Большую роль в активации митохондрий-опосредованного апоптоза оказывает нарушение целостности эндоплазматического ретикулума. Пусковым механизмом этого пути является выход из эндоплазматического ретикулума ионов Ca₂₊. Резкий подъем концентрации ионов Ca₂₊ в цитозоле повышает активность Ca₂₊-зависимой протеазы, активирующей каспазу-12, и открывает mPTP, нарушая проницаемость митохондриальной мембраны и усиливая выход белков из межмембранного пространства. В обзоре литературы мы ссылались на эту статью: «Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что при ишемическом и реперфузионном повреждении кишечной стенки митохондрий-опосредованный путь развития апоптоза играет ключевую роль» [5].

В современной хирургической практике огромного количества хирургических стационаров ОМИ диагностируют на поздних стадиях (гангрена кишки, перитонит), что, безусловно, определяется рядом факторов: тяжелыми сопутствующими заболеваниями пациента, поздней госпитализацией, отсутствием адекватной оценки состояния больного на этапе первичного обращения и др. Важно отметить, что ключевым звеном в развитии осложнений данного состояния является поздняя диагностика, которая не попадает во временное окно обратимости ишемии кишечной стенки, что чаще всего приводит к инкурабельному тотальному некрозу кишки.

При анализе литературы и клинических данных не было отмечено проявления у пациентов каких-либо специфических симптомов, которые с точностью могли бы говорить о развитии столь выраженной «катастрофы» органов желудочно-кишечного тракта на ранних этапах развития ОМИ [1, 6, 7].

Следует отметить, что лабораторная диагностика большинства больниц даже при наличии возможности в проведении сложных биохимических тестов ограничивается проведением рутинного клинического анализа крови и мочи, исследованием амилазы крови, что зачастую выявляет выраженный лейкоцитоз и при столь скудной клинической симптоматике на ранних этапах заставляет хирурга госпитализировать пациентов в стационар и использовать наблюдательную тактику, а также дальнейшее проведение диагностического поиска, что часто является губительным для пациентов. Наиболее специфическим и показательным методом исследования ОМИ является аортография с последующей селективной мезентерикографией. Дефекты контрастирования, отсутствие заполнения основного ствола и ветвей мезентериальных сосудов помогают в постановке окончательного диагноза, независимо от стадии заболевания. Важно отметить, что окклюзия сосудов может быть выявлена в самых начальных стадиях заболевания, еще до начала стадии инфаркта кишечной стенки [8]. Компьютерно-томографическая (КТ) ангиография достаточно информативна, но ее применение в современных условиях ургентной хирургии возможно лишь в крупных областных клиниках нашей страны. Использование артериографии с контрастированием трудноосуществимо также в большинстве районных и сельских больниц в связи с нехваткой необходимых специалистов, аппаратов КТ, а отсутствие специфических лабораторных маркеров заставляет врачей госпитализировать пациентов и ожидать «катастрофы» в животе, которая не разрешается консервативными методами, вместо того, чтобы направить больного в ближайшие крупные клиники для проведения высокотехнологичной квалифицированной помощи.

При анализе тематической литературы нами были выделены наиболее перспективные маркеры, которые возможно использовать в диагностике критической мезентериальной ишемии:

1. D-лактат. В естественных условиях обнаруживается только в микромолярных концентрациях в крови. Это связано с особенностями его метаболизма. D-лактат метаболизируется до пирувата в печени ферментом d-2 гидроксикислотдегидрогеназой. Бактерии, принадлежащие к естественной кишечной флоре, такие как Escherichia coli, Lactobacillus, Klebsiella и др., в анаэробных условиях могут вырабатывать d-лактат в повышенном количестве. Здоровая неизмененная слизистая оболочка кишки предотвращает d-лактат от попадания в системный кровоток. Однако во время резкой ишемии нарушается барьерная функция слизистой оболочки кишки, это облегчает транслокацию бактерий в стенку кишки и увеличивает проницаемость ее капилляров и слизистой оболочки, что приводит к попаданию высоких концентраций d-лактата в портальный кровоток и может сигнализировать о возможном развитии патологического состояния и, как следствие, быть потенциальным маркером ОМИ [9].

2. Глутатион-S-трансферазы (GST) представляют из себя семейство цитозольных ферментов, которые принимают участие в детоксикации продуктов обмена в клетке. При гипоксическом повреждении происходит их высвобождение. GST участвует в детоксикации ряда токсических соединений путем конъюгации глутатиона, они отличаются высокой активностью, особенно в печени и слизистой оболочке кишечника. При анализе литературы порог в 4 нг/мл для aGST был чувствительным для ОМИ в 100% наблюдений и специфичным в 86% [9, 10]. Если эти факты будут подтверждены, оценка aGST может надежно предсказать наличие или отсутствие ОМИ.

3. Белки, связывающие жирные кислоты (I-FABP). Это цитозолевые белки с низкой молекулярной массой (14—15 кДа). I-FABP принимают участие в поглощении и использовании жирных кислот для энергетических потребностей в клетках кишки. При нарушении целостности мембраны клеток-энтероцитов I-FABP из внутриклеточного пространства попадают в венозную систему. При развитии ОМИ и, как следствие, повреждении энтероцитов пороговые значения I-FABP резко увеличиваются, в анализах мочи и крови их уровень становится значительно выше по сравнению с таковым у здоровых лиц [1]. Значения I-FABP были также повышены как при сегментарных некротических изменениях кишечника, так и при тотальной ишемии всей кишки. Немаловажным является тот факт, что данный показатель не изменялся в случаях кишечной непроходимости с подозрением на ишемию и других острых заболеваний, связанных с кишечной стенкой. Исследования показали высокие чувствительность и специфичность (0,90 и 0,89 соответственно) показателей I-FABP [1, 9, 11].

4. Диаминооксидаза (ДАО) — фермент из класса оксидоредуктаз, относящийся к группе белков, которые используют молекулярный кислород и участвуют как катализатор во внутриклеточных реакциях окислительного дезаминирования диаминов и гистамина с получением соответствующих альдегидов, аммиака и перекиси водорода. Биохимическое значение ДАО в организме животных и человека определяется ее ролью в процессе обезвреживания биогенных диаминов, которые в свою очередь поступают из кишечника в результате обменных процессов. Крайне высокое значение этих показателей наблюдается в результате гнилостного распада белков (при воспалительных заболеваниях кишечника и прочих состояниях, связанных с резким нарушением обменных процессов в энтероцитах). ДАО является высокоспецифичным ферментом (специфичность 97%) [12] и может быть использована в качестве простого маркера для определения резкого нарушения обменных процессов кишки при возникновении нарушения мезентериального кровообращения.

5. Цитруллин — аминокислота, которая синтезируется энтероцитами кишечника и относится к классу органических соединений, известных как 1-альфа-аминокислоты. В организме человека максимально ее содержание наблюдается в энтероцитах, которые специфически образуют цитруллин из глютамина и производных некоторых аминокислот, преобразуя его через путь глутамата в орнитин, который затем метаболизируется в аргинин почками. Важно отметить, что почти исключительно весь цитруллин в организме человека присутствует в энтероцитах тонкой кишки. Этот факт позволил нам предложить его в качестве потенциального маркера органических изменений тонкой кишки. В ходе изучения метаанализов отечественной и зарубежной литературы показано, что уровень цитруллина может являться надежным маркером повреждения энтероцитов тонкой кишки при заболеваниях, связанных как с резким нарушением функции энтероцитов, так и с их повреждением вследствие нарушения внутриклеточного метаболизма [9, 10].

6. Фосфопротеин p53 — продукт гена-супрессора опухоли TP53, синтезируется во многих клетках желудочно-кишечного тракта. Изменение генетического аппарата клетки вследствие ишемического повреждения является сильным стрессовым фактором, который приводит к повреждению ДНК клетки и активирует p53, находящийся в неактивном состоянии. Происходит каскад реакций, который заключается в приобретении способности связываться с ДНК и усиливать транскрипцию внутриклеточных генов, в которых содержится регуляторная область, содержащая нуклеотидную последовательность (p53-response element). Можно сделать вывод, что p53 является фактором, запускающим транскрипцию генов. Результатом активации данного белка является остановка клеточного цикла и репликации ДНК внутри клетки, а также запуск апоптоза клетки при сильном стрессовом сигнале [13]. В неактивной форме p53 локализуется в цитоплазме клетки, а активная его форма находится в ядре. При отсутствии клеточного стресса p53 имеет короткий период полураспада (5—20 мин, в зависимости от локализации). Чрезмерная активация активности данного белка связана с увеличением его стабильности, тем самым можно сделать вывод, что фосфопротеин p53 может иметь крайне высокую ценность в определении ишемического повреждения энтероцитов из-за своей быстрой ответной реакции на развитие стрессового повреждения их ДНК.

7. Пероксиредоксин (PRDX3) — представитель семейства эффективных тиолпероксидаз. PRDX3 является распространенным и эффективным ферментом, участвующим в процессах утилизации H₂O₂ в митохондриях клеток. Это важный митохондриальный антиоксидантный белок, служащий «мишенью» для практически всего количества H₂O₂, продуцируемого в матриксе [4]. PRDX3 поглощает перекись водорода за счет окисления ее до неактивной формы. В ряде исследований также сообщалось, что PRDX3 активно принимает участие в процессах ингибирования окислительного стресса и апоптоза и тем самым ослабляет повреждающее действие на клеточные структуры. Накопленные активные формы кислорода в митохондриях, которые преимущественно состоят из радикалов·O₂^– и H₂O₂, являются основным источником внутриклеточного окислительного стресса при развитии ее ишемического повреждения. Большая часть O₂^–, образовавшегося в митохондриях, попадает в матрикс, что значительно ухудшает их функцию. Несмотря на то что O₂^– не могут проникать через мембрану митохондрий из-за своего отрицательного заряда, возможно их преобразование в прекисную форму (H₂O₂) с помощью ряда ферментов. Митохондриальная H₂O₂ легко диффундирует через мембраны, провоцируя окислительный стресс и повреждая клеточные макромолекулы, такие как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, особенно после его превращения в свободный радикал·OH. Высокий уровень митохондриальной H₂O₂ оказывает важную роль в повреждении стенки кишечника. Вредоносная H₂O₂ в клетке в основном удаляется PRDX3, что делает его мишенью почти для всех митохондриальных форм перекиси водорода, как следствие этого сверхэкспрессия PRDX3 поглощает избыток H₂O₂ и защищает клетки от индуцированного апоптоза [4]. Анализ изменений показателей пероксиредоксина может быть крайне информативным в ранней диагностике ОМИ еще на начальных проявлениях заболевания.

8. Оксид азота (NO.) играет центральную роль в физиологии желудочно-кишечного тракта. Основные источники NO. в кишечнике включают тучные клетки, эпителий слизистой кишки, гладкомышечные клетки, резидентные и/или инфильтрирующие лейкоциты (нейтрофилы, моноциты). В условиях покоя перфузия слизистой оболочки регулируется NO., полученным из сосудистого эндотелия брыжеечного ложа. Регуляция перистальтики и тонуса мышечной стенки опосредуется высвобождением NO, который в данном случае действует как основной нейромедиатор неадренергической, нехолинергической энтеральной нервной системы. Изменения в перистальтике гладкой мускулатуры кишечника, такие как острая непроходимость, ишемические состояния, являются результатом высоких концентраций оксида азота и его образования при эндотоксикозе [14]. NO. может защищать слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта от различных раздражителей (проглатывание едких веществ, повреждение вследствие ишемии/реперфузии, эндотоксический шок), поддерживая положительную перфузию слизистой оболочки. Данный процесс осуществляется благодаря ингибированию адгезии нейтрофилов к брыжеечному эндотелию, блокируя адгезию тромбоцитов и предотвращая активацию тучных клеток. Однако при чрезмерном накоплении NO. происходит обратный процесс. При высоких концентрациях NO. разрушает актиновый цитоскелет энтероцитов, ингибирует образование АТФ, расширяет плотные соединения клеток и создает сверхпроницаемое состояние для стенки кишки [4, 14].

9. Регулируемый глюкозой белок 78 (GRP78), или белок, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулина (BiP), является членом семейства белков теплового шока 70 (HSP70). Данный агент корректирует сворачивание и сборку, а также предотвращает транспортировку неправильно свернутых белков или белковых субъединиц в клетке. Экспрессия GRP78 резко возрастает в случаях выраженных стрессовых воздействий, например когда в клетке снижается количество энергетических питательных веществ, резко уменьшаются ее перфузионные свойства, нарушается митохондриальное дыхание и другие метаболические процессы. В случае перемещения GRP78 на поверхность клетки он способен взаимодействовать с большим количеством лигандов или других белков на поверхности той же клетки и работает как многофункциональный рецептор. GRP78 играет важную роль в клеточной передаче сигналов и участвует в процессах пролиферации, инвазии, апоптозе. Гипоксия является одним из тяжелых факторов нарушения передачи сигналов в клетке и способствует образованию новых неправильных стимулов. В ряде исследований показано, что гипоксическое воздействие на клетку энтероцитов, способствующее накоплению «ошибочных» и иных сигналов, вызывает повышение уровня CS-GRP78 более чем в 4 раза [15].

Таким образом, проблема острого нарушения мезентериального кровообращения остается крайне сложной и зачастую нерешаемой в условиях современных хирургических стационаров. Стертая клиническая картина и отсутствие лабораторных данных, подтверждающих столь грозное заболевание, приводят хирургов к излишнему диагностическому поиску и крадут время для начала лечения. Совокупность своевременной диагностической тактики, своевременное оперативное лечение с использованием эндоваскулярных методов, грамотное ведение послеоперационной реабилитации могут не только снизить летальность, но и продлить жизнь пациентам [16]. Огромное влияние на это, на наш взгляд, может оказать изучение представленных биохимических маркеров, которые помогут правильно направить хирурга и облегчить принятие решения о проведении КТ с контрастным усилением (аортомезентерикографией) и выполнении экстренного хирургического вмешательства, что является крайне важной и современной научной задачей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Сучков И.А., Зайцев О.В., Кочетков Ф.Д.

Сбор и обработка материала — Кочетков Ф.Д.

Статистическая обработка — Кошкина А.В.

Написание текста — Кочетков Ф.Д.

Редактирование — Сучков И.А., Зайцев О.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.