Фокальная ишемия головного мозга у крыс на фоне недостаточности эстрогенов и эндотелиальной дисфункции

В последние годы внимание специалистов привлекает изучение функции сосудистого эндотелия как одного из наиболее важных звеньев в патогенезе цереброваскулярных заболеваний. Особое место занимает эндотелиальная дисфункция (ЭД), возникающая в постменопаузальный период у женщин, так как при этом снижается содержание эстрогена — гормона, обладающего выраженными плейотропными, в том числе сосудистыми эффектами. Эстрогены обладают антиоксидантным, противовоспалительным и вазодилатирующим действием, активируя eNOS [1], поэтому у женщин после достижения менопаузы возрастает риск нарушений мозгового кровообращения и сердечно-сосудистых заболеваний [2]. Постменопаузальный период, моделируемый у животных путем овариэктомии (ОЭ), характеризуется усилением чувствительности сосудов к вазоконстрикторным агентам и снижению образования вазодилатирующих веществ, таких как оксид азота (NO) и эндотелиальный гиперполязирующий фактор, что также снижает эндотелийзависимую вазодилатацию [3].

Поэтому в последние годы активно исследуется ЭД, связанная с недостаточностью половых гормонов и ее ролью в патогенезе цереброваскулярных нарушений [4—6]. Однако результаты экспериментальных исследований эффективности гормональной терапии при недостаточности мозгового кровообращения у овариэктомированных животных достаточно противоречивы.

Моделирование недостаточности половых гормонов позволяет создать преморбидный фон, имеющий место в реальной клинической практике, предваряющий развитие цереброваскулярных расстройств, что в значительной степени увеличивает валидность скрининга церебропротективных средств.

Цель настоящего исследования — оценка влияния ОЭ на функциональные показатели выраженности повреждения головного мозга после фокальной ишемии у крыс: мозговой кровоток, эндотелийзависимую вазодилатацию, неврологический, локомоторный и мнестический дефицит.

Исследование было проведено на 48 крысах-самках линии Вистар массой 200—220 г (ПЛЖ «Рапполово», Санкт-Петербург). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу М.З. РФ № 267 от 19.06.03. «Об утверждении правил лабораторной практики». При проведении экспериментов учитывались требования Комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук и этические нормы, признанные мировым сообществом и изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985).

Оценка влияния ОЭ на последствия ишемии головного мозга проводилась на модели окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) у крыс.

Для исследования были сформированы следующие группы животных: ЛО — ложнооперированные животные, у которых осуществлялся операционный доступ к яичникам и матке без их удаления, а также к сонной артерии без введения филамента для ОСМА; ОЭ — животные, которые подвергались ОЭ без дальнейшего моделирования ОСМА; ОСМА — животные, которые подвергались ОСМА в отсутствие предварительной ОЭ; ОЭ+ОСМА — животные, которые подвергались ОЭ и ОСМА.

Исследование проводилось в следующей последовательности: через 1 сут после рандомизации животных осуществляли обучение в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «условная реакция пассивного избегания», через 2 сут у животных проводили О.Э. Спустя 30 сут осуществляли проверку сохранения рефлекса пассивного избегания и экстраполяционного избавления от аверсивной среды, после чего еще через 1 сут моделировали фокальную ишемию. Оценку моторного и мнестического дефицита проводили через 1, 4 и 7 сут после ишемии головного мозга, далее после наркотизации животных проводили оценку исходного мозгового кровотока и его изменение при введении модуляторов синтеза NO.

ОЭ осуществляли под хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг интраперитонеально) путем удаления яичников с телом матки. Для развития постменопаузальных изменений у животных после ОЭ отводилось 30 сут, после чего у них моделировалась фокальная ишемия головного мозга по методике, предложенной E. Longa и соавт. [7].

Неврологический дефицит оценивали через 1, 4 и 7 сут после ОСМА по шкалам Combs [8] и Garcia [9].

Итоговый балл по шкале Combs формируется как сумма баллов в 3 двигательных тестах, определяющих мышечную силу, цепкость-тягу и равновесие, что позволяет оценить функциональное состояние экстрапирамидной системы. Шкала оценки неврологического дефицита Garcia позволяет оценить асимметричность движений и реакций животного, итоговые данные формируются как сумма баллов 6 тестов: спонтанной активности, симметрии при движении лап, вытягивания лап, залезания по экрану-сетке, проприорецепции тела и вибриссе животных.

Более детально выраженность асимметрических моторных нарушений у животных оценивалась в тесте «сужающаяся дорожка» («Beam-walking test») [10]. Процесс тестирования регистрировался видеокамерой с последующим анализом числа соскальзываний противоположной конечностью и односторонней конечностью относительно стороны повреждения на борт нижерасположенной планки. Среднее значение актов соскальзывания, полученное в 3 испытаниях, бралось для анализа. Данные представляли в виде коэффициента асимметрии (KA), который рассчитывали по формуле [10]:

КА=КОПК+КООК,

ОКШНД

где: КОПК — количество ошибок противоположной конечностью; КООК — количество ошибок односторонней конечностью; ОКШНД — общее количество шагов на дорожке.

Исследование поведенческой активности животных проводилось с помощью теста «открытое поле», оценка мнестической функции — в помощью тестов «условная реакция пассивного избегания» и «экстраполяционное избавление» по схеме, описанной выше.

Оценку уровня мозгового кровотока животных осуществляли с помощью ультразвуковой флоуметрии на допплерографе Минимакс-Допплер-К (ООО «СП-Минимакс», Россия) с использованием датчика с рабочей частотой в 25 Гц, мозговой кровоток животных регистрировали в проекции средней мозговой артерии на стороне окклюзии. Для оценки вазодилатирующей функции эндотелия мозговых сосудов использовали комплексный методический подход, предложенный И.Н. Тюренковым и А.В. Воронковым [11], который заключался в изучении изменений уровня мозгового кровотока в ответ на введение различных модификаторов синтеза эндогенного NO. Используемые модуляторы системы NO вводились внутривенно, в следующей последовательности: 0,01 мг/кг ацетилхолина («Acrosorganics», США), 10 мг/кг нитро-L-аргинина («Acrosorganics», США) [11]. Каждое введение анализатора осуществлялось после возвращения уровня мозгового кровотока до исходного уровня. В зависимости от увеличения или уменьшения мозгового кровотока по отношению к исходному судили соответственно о расширении или сужении просвета сосудов у животных опытной и контрольной групп, а также об участии системы NO в регуляции тонуса сосудов.

Показатели балльной оценки неврологического дефицита в группе животных представлены медианой и интерквартильным размахом [25-й; 75-й перцентиль] [12]. В исследовании был запланирован промежуточный анализ данных. Сравнение данных проводили с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни. Попарные множественные сравнения данных осуществляли между группами ОСМА и ОЭ+ОСМА, а также между ОЭ и ОЭ+ОСМА с помощью критерия Крускала—Уоллиса. Различия принимались статистически значимыми при р<0,05. Обработку данных производили с помощью пакетов программ BioStat 2008 и Statistica 6.0.

В табл. 1 и 2 представлены результаты оценки исходного мозгового кровотока и его изменение при введении ацетилхолина и нитро-L-аргинина в исследуемых группах животных. В группах ЛО и ОЭ отмечалось выраженное статистически значимое изменение мозгового кровотока при введении модификаторов синтеза NO, что свидетельствовало о наличии сохранной реактивности мозговых сосудов. Наоборот, статистически незначимые малые изменения кровотока от исходного уровня наблюдались в группах ОСМА и ОЭ+ОСМА, что показывало снижение выработки стимулируемой и базальной продукции NO, эндотелийзависимой вазодилатации и, таким образом, говорило о наличии выраженной ЭД у животных этих групп. При этом в группе ОЭ+ОСМА отмечалось наименьшее статистически значимое изменение мозгового кровотока под влиянием ацетилхолина в сравнении с группой ОСМА, что показывало наличие более выраженной ЭД в этой группе.

Исходный уровень мозгового кровотока у овариэктомированных животных был статистически значимо меньше (на 34,3%), чем у ложнооперированных животных. Также статистически значимо мозговой кровоток был ниже у животных, перенесших ОСМА на фоне недостаточности эстрогенов, по сравнению с самками с ОСМА, но с сохраненными гормонпродуцирующими органами. Эти различия в уровне мозгового кровотока у животных с ОЭ и без нее подчеркивают важную роль половых гормонов в формировании тонуса церебральных сосудов. Можно предположить, что снижение кровотока у овариэктомированных самок обусловлено недостаточностью эндотелиотропного действия эстрогенов и развитием ЭД.

Таким образом, результаты оценки мозгового кровотока подтвердили наличие ЭД в группах животных после О.Э. При этом в условиях фокальной ишемии фиксировалось более выраженное нарушение мозговой гемодинамики и реактивности сосудов на введение модификаторов синтеза NO, т. е. более выраженная ЭД.

Моделирование ОЭ и ОСМА приводило к формированию неврологического дефицита, выраженность и динамика которого в большей степени различалась между группами в течение первых 7 сут после ОСМА (рис. 1). В группе ЛО у животных с 1-х по 7-е сутки наблюдался низкий уровень неврологического дефицита, поэтому он не указан на рисунке. Неврологический дефицит по обеим шкалам в группе ОСМА с 1-х по 7-е сутки снижался в 2—3 раза, в то время как в группе ОЭ+ОСМА он оставался на высоком уровне на протяжении 7 сут наблюдения. Так, у животных отмечалась низкая способность удерживаться на вертикальной сетке, горизонтальном стержне и веревке. По шкале Combs (см. рис. 1, а) неврологический дефицит у животных с комбинированной патологией, т. е. в группе ОЭ+ОСМА, через 4 и 7 сут после ОСМА был выше в 3 раза по сравнению с группой животных, у которых была проведена только ОЭ.

По шкале Garcia через 4 и 7 сут после моделирования ОСМА наблюдалось двукратное различие между показателями группы ОЭ и группы ОЭ+ОСМА (см. рис. 1, б). Через 4 сут различия между медианами в группах ОСМА и ОЭ+ОСМА составляло 4 балла, а через 7 сут — 5 баллов соответственно, что выражалось в нарушении симметрии моторики движения конечностей, а также реакции на прикосновения к телу и вибриссам.

Таким образом, оценка неврологического дефицита после моделирования ОЭ и ОСМА показала, что в результате сочетанного воздействия повреждающих факторов (недостаточность половых гормонов и фокальная ишемия, вызванная ОСМА) формируется стойкий неврологический дефицит, сохраняющийся на протяжении 7 сут после ОСМА.

Асимметрические нарушения моторики у животных с ОЭ и ОСМА оценивали по тесту «сужающаяся дорожка» (рис. 2). В группах ЛО и ОЭ медианы показателей асимметрии на протяжении всего периода тестирования и участках дорожки были приблизительно равны нулю, поэтому они не указаны на рисунке и в таблицах.

Результаты тестирования показали, что через 1 сут после ОСМА у животных был выраженный асимметрический дефицит, который прогрессировал к 7-м суткам после моделирования. Так, у животных с сочетанной патологией (ОЭ и ОСМА) через 4 и 7 сут на всех участках дорожки количество соскальзываний противоположной конечностью значительно превышало количество соскальзываний односторонней конечностью и, таким образом, показатель асимметрии был больше в 2 раза, чем в группе ОСМА (см. рис. 2).

Анализ асимметрии моторики животных на одном и том же участке дорожки через 4 и 7 сут после ОСМА показал, что в группе ОСМА процент асимметрии менялся незначительно. Однако для группы ОЭ+ОСМА показатель через 7 сут оказался в 2 раза выше, чем таковой в предыдущий период наблюдения через 4 сут после ОСМА, что свидетельствовало о более выраженном нарастании моторных нарушений у животных этой группы к 7-м суткам после нанесения повреждения (см. рис. 2).

Таким образом, у животных на фоне недостаточности половых гормонов ишемия головного мозга развивалась более тяжело, что выражалось в статистически значимом отличии баллов неврологического дефицита и моторных нарушений по сравнению с животными с сохранной репродуктивной системой. Эти нарушения наиболее выражены через 7 сут после проведения ОСМА.

Профиль поведенческой активности животных является маркером нарушений функционирования ЦНС в результате ее повреждения [13]. На этапе обучения у всех животных отсутствовали какие-либо хирургические вмешательства, поэтому их показатели не различались и не показаны на рис. 3.

На этапе 1-го воспроизведения у животных в группах ОЭ и ОЭ+ОСМА наблюдалось снижение как поведенческой, так и ориентировочно-исследовательской активности в тесте «открытое поле». При 2-м воспроизведении теста «открытое поле» после моделирования ОСМА отмечалось двукратное снижение двигательной активности у животных в группе ОСМА и трехкратное — в группе ОЭ+ОСМА. Ориентировочно-исследовательская активность животных снижалась только в 1,5 раза в группе ОСМА, а в группе ОЭ+ОСМА незначительно, так как исходно этот показатель был низким (см. рис. 3). Таким образом, стоит отметить, что у животных с сочетанной патологией наблюдалось более выраженное снижение двигательной активности, чем в случае моделирования только ОЭ или ОСМА.

У животных с недостаточностью половых гормонов и ОСМА наблюдались выраженные нарушения мнестической функции (табл. 3). На этапе 1-го воспроизведения навыка отмечалось некоторое снижение латентного периода входа в отсек животными и повышение латентного периода подныривания животных с О.Э. Далее, после моделирования ОСМА, на этапе 2-го воспроизведения отмечался очень короткий латентный период входа в темный отсек и большой латентный период подныривания в группах животных с ОСМА. Однако у животных с ОСМА и недостаточностью половых гормонов мнестические нарушения были более выражены, чем в группах животных только с ОСМА или ОЭ.

Таким образом, фокальная ишемия головного мозга вызывала амнестическое действие на животных, которое значительно усиливалось на фоне ОЭ.

Известно, что недостаточность эстрогенов ведет к формированию ЭД и росту вероятности развития заболеваний сердечно-сосудистой системы [1]. Можно предположить, что недостаточность эстрогенов может являться фактором, отягощающим течение и прогноз острых нарушений мозгового кровообращения, так как ауторегуляция церебрального кровообращения зависит от структурно-функциональной целостности эндотелиального слоя и играет важнейшую роль в компенсации патологических процессов при ишемическом повреждении головного мозга [1, 5].

В настоящем исследовании было показано, что мозговой кровоток в группе овариэктомированных животных с ОСМА был снижен на 20% по сравнению с животными без недостаточности эстрогенов. При этом изменения мозгового кровотока были менее выражены при введении модификаторов синтеза NO у животных с ОСМА и недостаточностью половых гормонов, чем у самок только с ОСМА или с О.Э. Известно, что ЭД оказывает прямое повреждающее воздействие на функциональность сосудистой стенки и ауторегуляцию мозгового кровообращения [3], что и было подтверждено в настоящем исследовании.

Также был проведен анализ показателей неврологического, моторного, локомоторного и мнестического дефицитов на различных этапах моделирования ОЭ и ОСМА и их сочетания с целью выявления выраженности эффекта каждого из них. Оценка общих моторных нарушений конечностей по шкале Combs не выявила статистически значимой суммации эффектов ЭД и фокальной ишемии, что, очевидно, было связано с довольно широким разбросом показателей животных на балльной шкале в группе ОЭ+ОСМА. Однако результаты оценки асимметрического моторного дефицита по шкале Garcia показали существенное влияние ОЭ на последствие фокальной ишемии. Так, через 7 сут после ОСМА медиана баллов по этой шкале составила 6,0, что свидетельствовало о наличии выраженной асимметрии моторики конечностей (p<0,05) (см. рис. 1, б).

Стоит отметить, что с 1-х по 7-е сутки от момента повреждения наблюдалось постепенное повышение баллов и соответственно снижение моторного дефицита по обеим шкалам в группе животных с фокальной ишемией, что отражает динамику постепенного восстановления функций. ЭД, предшествующая фокальной ишемии, может существенно усиливать ее повреждающее действие и/или снижать компенсаторные и репаративные возможности организма. Так, в настоящей работе было показано, что в группе ОЭ+ОСМА начальные проявления инсульта были более выражены, чем в группе ОСМА, но что более важно, не наблюдалось постепенного регресса проявлений ишемии с течением времени.

Тест «сужающаяся дорожка» (см. рис. 2) выявил тенденцию нарастания дисфункции моторной системы в интервале от 1 до 7 сут после ОСМА, однако эффект увеличения проявлений двух патологий был выявлен только на 7-е сутки после ОСМА, где показатели групп ОСМА и ОЭ+ОСМА статистически значимо различались. При этом величина этих различий увеличивалась при сужении дорожки, т. е. с усложнением задачи для животных.

В тесте «открытое поле» двигательная активность животных была более подвержена снижению при воздействии недостаточности половых гормонов при ОЭ и фокальной ишемии. Так, на рис. 3, а видно, что двигательная активность всех животных из группы ОЭ+ОСМА была значительно снижена. При этом ориентировочно-исследовательская активность существенно не различалась в группах животных с одним или комбинированным повреждением (см. рис. 3, б).

В тесте «условная реакция пассивного избегания» отмечены в 2 раза более выраженные нарушения когнитивной функции у животных с ОЭ и ОСМА по сравнению с группой ОСМА. Показатели животных в тесте «экстраполяционное избавление» не имели статистически значимой разницы.

Известно, что большинство инсультов у женщин протекает в постменопаузальном периоде, когда ведущим звеном цепи патологического процесса при сердечно-сосудистых заболеваниях является ЭД [1]. В настоящем исследовании было показано, что ЭД, вызванная ОЭ, оказывала выраженное патологическое влияние на развитие и последствия фокальной ишемии у самок крыс. Это воздействие проявлялось в более выраженном формировании у животных асимметрических моторных нарушений, а также нарушений локомоторной и мнестической активности, связанной с воспроизведением памятного следа в условиях менее аверсивной среды. Было также показано значительное снижение церебральной гемодинамики в условиях ЭД у животных с фокальной ишемией, что, по-видимому, являлось ключевым звеном в развитии вышеуказанных патологических процессов.

Мозговой кровоток в проекции среднемозговой артерии на стороне окклюзии у овариэктомированных животных через 7 сут после ОСМА был снижен в 2 раза по сравнению с животными, не подвергшимися О.Э. При этом у овариэктомированных животных наблюдалась в 2—3 раза менее выраженная реакция мозгового кровотока при введении ацетилхолина и нитро-L-аргинина, что говорит о развитии у них более тяжелой ЭД.

ОСМА на фоне ОЭ приводит к формированию в 2 раза более выраженного неврологического дефицита, моторной асимметрии и снижению поведенческой активности животных в 3 раза в тесте «открытое поле», снижению памяти в 1,5 раза в тесте «условная реакция пассивного избегания» и в 2 раза в тесте «экстраполяционное избавление» по сравнению с моделированием ишемии на фоне нормального гормонального фона через 7 сут после ОСМА.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.