Влияние целлекса на функциональные и морфологические изменения при экспериментальной фокальной ишемии префронтальной коры головного мозга

В последние годы расширился фронт исследований, направленных на изучение патогенеза ишемического поражения головного мозга и поиск фармакологических препаратов, предназначенных для стимуляции регенераторных процессов при данной патологии [1].

Одной из экспериментальных моделей, которая наиболее полно воспроизводит клиническую картину фокального ишемического инфаркта мозга, является фотохимический тромбоз кровеносных сосудов коры [2]. Данный неинвазивный метод позволяет выбрать требуемую локализацию коркового инфаркта, объем которого воспроизводится из опыта в опыт, что позволяет получить статистически значимые количественные данные о степени повреждения мозга, динамике патологических и репаративных процессов в фокальном ишемическом очаге. Использование данной модели дает возможность количественной оценки нейропротективного действия препаратов, используемых для фармакологической коррекции ишемической патологии мозга [3, 4].

Цель настоящего исследования - изучение в эксперименте на модели фототромбоза префронтальной коры действия нового оригинального препарата целлекс на функциональную деятельность ЦНС и объем ишемического повреждения коры головного мозга при его внутрибрюшинном одноразовом или хроническом введении крысам как до, так и после создания ишемического очага в коре.

Работа выполнена на 90 самцах беспородных крыс массой 200-250 г, выращенных в виварии Института общей патологии и патофизиологии РАМН. Животные содержались в виварии при свободном доступе к пище и воде и 12-часовом световом режиме. При работе с крысами соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.

В ЗАО «Фарм-Синтез» разработан новый оригинальный препарат целлекс, представляющий комплекс органоспецифических сигнальных слабокислых белков массой от 10 до 140 кДа - факторов роста и дифференцировки нервной ткани, полученный из эмбрионального мозга сельскохозяйственных животных (свиней) на определенной стадии гестации. В экспериментальных и первых клинических исследованиях показана эффективность и безопасность препарата при ишемических повреждениях мозга и тяжелых коматозных состояниях.

Препарат использовали для коррекции функциональных и морфологических нарушений при фотохимическом тромбозе сосудов префронтальной коры головного мозга крыс.

Все взятые в эксперимент животные были разделены на следующие группы по10 животных в каждой: ложнооперированные - ЛО; крысы с двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры головного мозга, которым вводили внутрибрюшинно физиологический раствор в объеме 0,5 мл - Иш + физ. раствор; крысы с таким же повреждением коры и внутрибрюшинным введением по схеме целлекса в объеме 0,5 мл в разных дозах - Иш + целлекс.

Целлекс вводили крысам внутрибрюшинно ежедневно в течение 4 дней после фототромбоза коры в дозах 0,4 мг/кг (10 животных) и 3,0 мг/кг (10 животных), а другой группе крыс (10 животных) одноразово (3,0 мг/кг) через 1ч после фототромбоза префронтальной коры. Отдельно была выделена группа животных (10 особей) с введением целлекса в дозе 3,0 мг/кг в течение 4 дней до ишемического повреждения коры - премедикация. В качестве препарата сравнения после фототромбоза префронтальной коры вводили по той же схеме, как и целлекс, кавинтон - доза 4, 0 мг/кг (10 животных).

Двусторонний фокальный ишемический инфаркт префронтальной коры головного мозга крыс - поля Fr1 и Fr2 согласно стереотаксическому атласу [5] - создавали методом фотоиндуцируемого тромбоза [2].

Животных наркотизировали хлоралгидратом (300 мг/кг внутрибрюшинно). Фотосенсибилизируемый краситель бенгальский розовый (Sigma Chem.Co.) вводили в яремную вену (3% раствор, 40 мг/кг). Голову животного фиксировали в стереотаксисе и после продольного разреза кожи удаляли надкостницу. Световод (диаметр светового пучка на выходе 3 мм) устанавливали на расстоянии 1 мм от поверхности черепа по координатам: 2 мм ростральнее брегмы и 2 мм латеральнее сагиттального шва. Облучение холодным светом - λ=560 нм (источник - лампа мощностью 250 Вт, охлаждаемая вмонтированным в установку вентилятором) проводили в течение 20 мин с каждой стороны. Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, за исключением введения бенгальского розового.

Оценку функционального состояния ЦНС крыс (обучение и память) проводили по показателям латентного периода (ЛП) условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Выработку УРПИ осуществляли в челночной камере отечественного производства Биотест РК-5201. В первый день обучения крысу помещали в освещенный отсек (лампа мощностью 100 Вт), обследовав который, она через несколько секунд переходила в темный, после чего дверцу в этот отсек камеры закрывали и оставляли там крысу в течение 300 с. Через 1 ч процедуру повторяли, но крысу сразу после перехода извлекали из темного отсека. На следующий день эту же процедуру повторяли дважды с часовым перерывом. При повторном заходе животного в темный отсек камеры дверцу в него закрывали и через металлические прутья пола пропускали электрический ток (1,3 мА, 50 Гц, 5 с). УРПИ считали выработанным, если ЛП пассивного избегания составлял 300 с и больше, животных с меньшими показателями исключали из эксперимента.

Объем очага повреждения коры фотоиндуцированным тромбозом определяли по формуле: V=Σ(Snd), где d - толщина пары срезов (200 мкм); Sn - измеренная площадь ишемического очага серийного среза в мм²; Σ - сумма объемов ишемического повреждения.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы BIOSTAT. Несколько групп сравнивали по одному признаку при помощи непараметрического метода сравнения независимых групп (метод Краскала-Уоллиса). Если этот анализ выявлял уровень значимости 0,05 или меньше, то попарное сравнение между группами проводили, используя метод Манна-Уитни. Различие в пределах каждой группы между дооперационными и послеоперационными показателями оценивали по критерию Вилкоксона.

Оценку нейропротективного действия целлекса проводили на 7-е сутки после индукции коркового инфаркта. Схема введения целлекса животным предусматривала возможность его воздействия на процессы, происходящие как в остром периоде, так и на более отдаленных этапах ишемии. Введение препарата прекращали за 3 суток до тестирования, чтобы исключить его кратковременные эффекты, влияющие на память и поведение.

Через 7 суток после фототромбоза были выявлены значительные изменения в поведении животных. Показатели двигательной активности снижались по сравнению с исходным уровнем, однако не было выявлено статистически значимых различий при сравнении всех групп животных после фокального коркового инфаркта. Это указывает на то, что уменьшение двигательной активности, по-видимому, обусловлено реакцией животных на наркоз и манипуляции, связанные с проведением операции, но не с самим повреждением префронтальной области коры.

При проверке сохранения рефлекса на 7-е сутки после очагового ишемического повреждения префронтальной коры значения ЛП УРПИ достоверно снижались по сравнению с исходным уровнем -113 с по сравнению с 300 с; p<0,05 (рис. 1).

Проявление действия целлекса через 3 суток после его отмены указывает на формирование устойчивых изменений, которые могут быть связаны как с уменьшением степени повреждения корковых структур, так и с изменениями на уровне медиаторных, метаболических или трофических систем.

Морфометрическое исследование очагов ишемического повреждения префронтальной коры крыс показало, что хроническое (табл. 1)

Защитный нейропротекторный эффект нагляднее виден, если вычислить коэффициент эффективности защиты (КЭЗ) по формуле:

КЭЗ=(Vо–Vв)/Vо·100%,

где Vо - средний объем очага поражения у животных с введением физраствора, Vв - средний объем очага поражения у животных с введением вещества. Этот параметр позволяет сравнивать эффективность действия различных доз веществ на моделях ишемии. В данном случае КЭЗ при введении целлекса в разных дозах через 1 ч после ишемического повреждения коры и далее ежедневно в течение 4 послеоперационных дней равен:

КЭЗ (0,4 мг/кг)=(8,3–5,9)/8,3·100%=29%.

КЭЗ (3,0 мг/кг)=(8,3–4)/8,3·100%=52%.

Гистологическое исследование показало бóльшую сохранность пенумбры - области мозговой ткани вокруг ишемического очага, где и происходят регенеративные процессы, вследствие которых улучшается сохранение памятного следа при применении целлекса. На рис. 2,

Объемная реконструкция очага ишемического поражения, полученная с помощью наложения серии последовательных срезов мозга, позволяет лучше представить размер повреждения (см. рис. 2, Б).

Результаты изучения специфической фармакологической активности белково-пептидного комплекса целлекс на модели острой очаговой корковой ишемии, вызванной методом фотоиндуцированного тромбоза, показали высокую антиамнестическую активность препарата. Морфологическое исследование мозга ишемизированных животных при сравнительном анализе леченных целлексом и нелеченных животных, получавших в том же объеме физиологический раствор, выявило нейропротективный эффект препарата со значительным снижением объема ишемического повреждения (до 50%).

В основе обнаруженных эффектов нового белково-пептидного комплекса может лежать способность целлекса оказывать прямое нейрорепаративное действие, снижать активацию провоспалительных реакций, вызванных ишемией, стимулировать синтез нейротрофинов и предотвращать гибель нейронов после фокального коркового инфаркта.

Еще в ранних работах отечественных ученых было выявлено наличие органоспецифических сигнальных белков (ОСБ) в эмбриональных тканях [6]. В последние годы было показано, что ОСБ в виде эмбриональных индукторов способны регулировать процесс трансформации стволовых клеток в нейроны, контролируя экспрессию нейрональных генов [7].

Было убедительно доказано, что процессы регенерации аксонов, клеток глии и нейронов в мозге человека активно происходят в ответ на повреждения, в частности, при ишемии, инсульте, травмах [8-10]. Кроме того, установлено, что этот процесс обеспечивается запасом клеток предшественников - нейробластов, которые постоянно образуются в гиппокампе из экзогенных нейрональных стволовых клеток, запас которых в мозге также постоянно пополняется из пула полипотентных стволовых клеток [11].

Установлены молекулярные механизмы, лежащие в основе восстановления тканей головного мозга после инсультов. Было показано, что миграцией нейрональных стволовых клеток и нейробластов, замещающих погибшие нейроны в поврежденных областях, управляют ОСБ - факторы роста и дифференцировки, вырабатываемые клетками вновь формирующихся кровеносных сосудов. Однако при обширных ишемических поражениях мозга и кровоизлияниях формирование новых сосудов либо длительно не происходит, либо крайне ограничено, что является основной причиной высокой смертности при этих состояниях. Поэтому в настоящее время ведутся исследования по разработке методов и лекарственных препаратов в качестве средств заместительной терапии при инсультах, травмах и других повреждениях мозга с целью обеспечения оптимальной регенерации поврежденных участков мозга [12].

Таким образом, функциональная оценка эффектов целлекса по показателям сохранения УРПИ показала, что при его постишемическом хроническом введении сохранение и воспроизведение УРПИ достоверно улучшается. Хроническое (ежедневное в течение 4 послеоперационных дней) и даже одноразовое (через 1 ч после операции) введение препарата значительно уменьшает очаг ишемического повреждения; введение целлекса в течение 4 суток до фототромбоза (премедикация) менее эффективно.