О модели цисплатиновой ототоксичности на крысах Wistar

Моделирование цисплатиновой ототоксичности (ЦО) in vivo широко используется при разработке способов отопротекции. При этом не выработан единый подход для ее получения. Нет понимания, в чем преимущества и недостатки однократного, многократного, внутрибрюшинного и внутривенного введений, различных доз в диапазоне от 1 до 16 мг на 1 кг массы тела (мг/кг), применения лабораторных животных разных видов и линий [1—3]. Так, оптимальным экспериментальным объектом для моделирования ЦО считают крыс линии Фишер (F344). Последние характеризуются особенностями высшей нервной деятельности, синаптической пластичности [4], сенсорики, в частности слуховой [5, 6], повышенной чувствительностью к фармакологическому воздействию [7]. На крысах F344 при моделировании ЦО стабильно развиваются такие же аудиологические повреждения, какие отмечены и в клинике: снижение амплитуды отоакустической эмиссии (ОАЭ), депрессия параметров комплекса коротколатентных слуховых вызванных потенциалов (КСВП) [8, 9]. При этом известно, что в отечественных питомниках эту линию не разводят, что делает актуальным вопрос о моделировании ЦО на более доступных экспериментальных объектах.

Цель исследования — разработать и валидировать модель повреждения слухового анализатора на крысах Wistar, отвечающую специфическому характеру цисплатиновой ототоксичности.

Лабораторные животные. Эксперимент выполнен на крысах стока Wistar SPF-статуса (n=24), половозрелых самцах массой 300—340 г с нормальной отоскопической картиной (Научно-производственное подразделение «Питомник лабораторных животных» ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» Минобрнауки России). Животных содержали в виварии барьерного типа Института экспериментальной медицины (ИЭМ) ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России в стандартных условиях светового режима и со свободным доступом к воде и корму.

Исследование проведено в соответствии с «Политикой работы с лабораторными животными» ИЭМ ФБГУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России, основанной на положениях Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета ЕС о защите животных, используемых в научных целях (EU Directive 2010/63/EU for animal experiments https://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm). Протокол эксперимента одобрен комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных ИЭМ ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России (протокол-заявка №2025/Rn/20/Журавский/V2 от 28 октября 2025 г.).

Фармакологический препарат. В работе использовали официнальный препарат «Цисплатин-РОНЦ» в виде готового раствора с концентрацией 1 мг/мл производства ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Моделирование цисплатиновой ототоксичности. Крыс случайным образом разделили на четыре экспериментальные группы по 6 голов (12 ушей) в каждой. Введение ЦП проводили однократно внутрибрюшинно без разведения в дозах 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг, 12 мг/кг. Последние определены на основании данных литературы [1, 2]. Ветеринарный осмотр проводили ежедневно, взвешивание — перед началом и каждые 7 дней в течение 30 сут эксперимента, применяли лабораторные весы DX-1200 WP (A&D Company Ltd., Япония).

Аудиологическое обследование. Периферический участок слуховой системы, слуховые пути и центры оценивали методами регистрации ОАЭ и КСВП на приборе Нейро-Аудио (ООО «Нейрософт», Россия) с программным обеспечением «Нейро-Аудио.NET» (версия 1.0.105.1 от 29.04.2022) с обновлением под задачу получения высокочастотных (ультразвуковых) тонов.

Амплитуду продукта искажения (ПИ) ОАЭ оценивали в диапазоне 6—11,4 кГц в дБ SPL по отработанной на крысах методике [10]. Данные о КСВП получали монаурально в ответ на стимуляцию тонами 20 кГц и 30 кГц в свободном звуковом поле. Оценивали порог слуха, амплитуду и латентность II пика. Последний выбран, поскольку у крыс он оказывается наиболее выраженным [11—13], характеризуя при этом активность кохлеарных ядер продолговатого мозга [14]. Метод аудиометрии у крыс по определению порога КСВП в ответ на подачу ультразвуковых тонов разработан нами и подробно описан ранее [15]. Данные аудиологического обследования представлены для выживших животных группы с введением ЦП 6 мг/кг исходно (в интактном состоянии) и на 30-е сутки после введения ЦП.

Гистологический анализ. Патоморфологическую картину спирального ганглия (СГ) оценивали на гистологических препаратах височных костей, фиксированных формалином, декальцинированных с помощью раствора «Софтидек» (ООО «Биовитрум», Россия), с приготовлением парафиновых срезов, окрашенных гематоксилином и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Препараты почек готовили и окрашивали по общепринятой методике. Микроскопическую оценку проводили на световом микроскопе Eclipse Ni (Nikon, Япония) с использованием окуляра ×10, объективов ×4, ×20 и ×40. Цифровые изображения получали с помощью фотокамеры Nikon DS-Fi3 и программы анализа цифрового изображения NIS-Elements D 5. 41. 02.

Биохимический анализ крови. Для оценки нефротоксичности ЦП определяли концентрацию креатинина в плазме методом иммуноферментного анализа (ИФА) на автоматическом комбинированном ИФА и биохимическом анализаторе Chem Well 2910 Combi (Awareness Technology, Inc., США) с помощью тест-системы «Креатинин-Ольвекс» (ООО «Ольвекс диагностикум», Россия). В качестве контрольного значения принимали референсный интервал креатинина для интактных здоровых животных данного вида: 45—75 мкмоль/л [16].

Статистический анализ. Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение Statistics 26 (IBM Corporation, США). Учитывая число элементов в каждой выборке, использовали непараметрические методы анализа. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха: Me (Q25; Q75). Различия между группами оценивали с помощью T-критерия Уилкоксона.

В течение первых 14 сут наблюдения у животных всех групп отмечали проявления системной токсичности разной степени выраженности: позу хронического стресса, признаки обезвоженности, вялый кожный и мышечный тургор, снижение массы тела, выпадение шерсти и диарею. Следует отметить, что диарея оказывалась прогностическим признаком скорого летального исхода, который происходил обычно на 6—9-е сутки эксперимента. Общие токсические проявления зависели от дозы: погибли или были эвтаназированы по гуманным соображениям 3 крысы, получившие ЦП в дозе 8 мг/кг, все крысы, получившие ЦП в дозе 10 мг/кг и 12 мг/кг. К 30-м суткам эксперимента выжили 3 из 6 крыс, получивших дозу ЦП 8 мг/кг, 6 крыс, получивших 6 мг/кг. У всех из них к концу 1-го месяца наблюдения вернулась прежняя активность, восстановились масса и шерстяной покров (рис. 1).

Рис. 1. Динамика массы животных (n=6) группы введения цисплатина в дозе 6 мг/кг, г (Т-критерий Уилкоксона).

Ц — цисплатин.

Учитывая, что у крыс Wistar введение ЦП в дозах 10 мг/кг и 12 мг/кг вызывало 100% летальность, ожидаемы наиболее выраженные аудиологические изменения в периоде дожития. Их патогенез связан не только со специфической ЦО, но и с влиянием факторов системной интоксикации, в частности с острой почечной недостаточностью вследствие цисплатиновой нефротоксичности. Исходя из этих соображений, анализировали только данные аудиологического обследования группы с полной выживаемостью — с введением дозы 6 мг/кг (рис. 2, 3).

Рис. 2. Динамика амплитуды продукта искажения отоакустической эмиссии (ПИОАЭ) у крысы, дБ SPL.

а — исходно; б — на 30-е сутки после введения цисплатина 6 мг/кг.

Рис. 3. Коротколатентные слуховые вызванные потенциалы крысы Wistar в ответ на ипси-стимуляцию тоном 20 кГц в свободном звуковом поле.

а — исходно (порог КСВП 35 дБ); б — на 30-й день после введения цисплатина 6 мг/кг (порог КСВП 45 дБ). КСВП — коротколатентные слуховые вызванные потенциалы.

Результатом однократного введения ЦП стало уверенное снижение амплитуды ПИ ОАЭ для зоны 10 кГц (p=0,043). При анализе КСВП отмечено повышение порога до 40—45 дБ на подачу тона 30 кГц для 3 из 12 ушей. Амплитуда II пика комплексов, полученных на стимулы с интенсивностью 85 дБ, была ниже для 30 кГц (p=0,012). Латентность при этом не менялась. Динамика аудиологических показателей одного из случаев отодепрессии представлена на рис. 1, 2. Данные статистической обработки приведены на рис. 4.

Рис. 4. Динамика аудиологических показателей у крыс, получивших однократную дозу цисплатина 6 мг/кг. Сравнение исходных данных и данных через 1 мес (Т-критерий Уилкоксона).

а — порог КСВП в ответ на тоновую подачу 20 кГц; б — амплитуда продукта искажения отоакустической эмиссии в зоне 10 кГц; в — амплитуда II пика КСВП в ответ на тоновую подачу 20 кГц с интенсивностью 85 дБ; г — амплитуда II пика КСВП в ответ на тоновую подачу 30 кГц с интенсивностью 85 дБ. Цис до — исходные значения, до введения цисплатина; Цис после — значения спустя 1 мес после введения цисплатина. КСВП — коротколатентные слуховые вызванные потенциалы.

Данные аудиологического обследования показывают, что однократное введение ЦП в дозе 6 мг/кг приводит к отодепрессии умеренной степени выраженности. На необратимый характер повреждения указывают изменения, наблюдающиеся в подостром периоде, спустя 1 мес после введения ЦП, а также гистологический анализ, выявляющий повреждение нейронов. Особенностью патоморфологического субстрата ЦО при таком способе моделирования являлись пикноз нейронов СГ, появление так называемых клеточных теней, представляющих собой цитоплазму измененной структуры, без четко очерченного ядра и с отсутствием ядрышка. Визуально наблюдалось снижение клеточности с появлением участков запустения, соответствующих местам нахождения бывших нейронов (рис. 5).

Рис. 5. Гистологическое исследование. Спиральный ганглий основного завитка улитки крысы.

а — интактная крыса; б — крыса через 30 сут после однократного введения цисплатина в дозе 6 мг/кг. Окраска гематоксилином и эозином, ×400. Стрелками отмечены нейроны в состоянии пикноза; * — клеточные тени.

Почки, полученные в ходе некропсии, макроскопически были увеличенного размера, дряблыми, с кистозными фокусами на поверхности. Гистологическая картина паренхимы представлена изменениями диффузного характера. В корковой зоне видны гиперемия капилляров почечных клубочков, интерстициальный отек, локусы лимфомоноцитарной инфильтрации. В мозговом слое — разной интенсивности тотальное повреждение в виде дистофии, некроза канальцевых эпителиоцитов, приводящих к атрофии и кистозной дегенерации тубулярной зоны (рис. 6). Признаков фиброзирования интерстициальной ткани в этом периоде еще не было. Полученные изменения объединяются понятием тубулоинтерстициального нефрита. Вместе с тем показатель креатинина плазмы у животных этой группы к окончанию эксперимента соответствовал референсному интервалу интактных крыс.

Рис. 6. Гистологическое исследование. Почка крысы через 1 мес после однократной инъекции цисплатина в дозе 6 мг/кг.

а — интерстиций корковой зоны, ×100; б — участок мозгового вещества с просветами канальцев, ×200. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками отмечены участки интерстициальной инфильтрации. * — зоны кистообразования; # — просветы поврежденных канальцев.

Достигнуть стабильных аудиологических изменений, возникающих в рамках ЦО, без высокого риска последующей гибели животных становится непростой задачей [1]. У ряда взрослых крыс с введением ЦП в дозе 8 мг/кг и у всех с введением ЦП в дозе 10 мг/кг и 12 мг/кг в ближайшие сроки дожития (в первые 14 дней) наблюдается летальный исход, вызванный общим интоксикационным синдромом. Визуально это проявляется кахексией, клиникой острой почечной недостаточности, энтероколитом. При этом потеря массы и нефротоксичность еще могут компенсироваться за счет адаптационных возможностей организма, а появление диарейного синдрома, являющегося проявлением геморрагического энтероколита, становится результатом применения доз, несовместимых с выживанием.

Все это указывает на недопустимость разовых доз ЦП более 6 мг/кг для моделирования ЦО на крысах. Некорректно это будет даже для экспериментов с короткими сроками наблюдения (от нескольких дней до 1—2 нед). Возбудимые структуры улитки в этих случаях помимо специфического (собственно цисплатинового) повреждения испытывают воздействие и повреждающих факторов, связанных с нарастающей полиорганной недостаточностью [17].

По нашим результатам видно, что только при дозе 6 мг/кг организму взрослой крысы удается самостоятельно, с помощью естественных компенсаторных механизмов реализовать свой адаптационный потенциал. Вместе с тем после этой дозы в подостром периоде наблюдаются необратимые гистологические изменения, характерные для тубуло-интерстициального нефрита [18]. Однако прибавка массы, уровень креатинина плазмы в пределах референсных значений здоровых животных к концу 1-го месяца после однократного введения ЦП, очевидно, указывают на компенсацию нарушенных функций. Аудиологическими проявлениями в этом случае становятся депрессия амплитуды ПИ ОАЭ на 10 кГц, умеренное повышение порога КСВП, снижение амплитуды его II пика при подаче тона 30 кГц (p=0,012). Явное снижение ответов на более высокой из двух предъявляемых частот и для ОАЭ — 10 кГц и для КСВП — 30 кГц отражает известный градиент нарастания чувствительности к повреждению сенсоневральных зон, расположенных ближе к основанию улитки. Сохранность латентности пика II объясняется меньшей чувствительностью к повреждению миелиновой оболочки. Это соответствует представлениям о том, что ЦП не проникает через гематоэнцефалический барьер и поэтому не проявляет выраженной нейротоксичности [19].

У человека развитие тугоухости в результате применения ЦП определяется факторами повышенной индивидуальной чувствительности и кумулятивной дозой [8]. Это объясняет, почему необязательно появляются признаки повреждения слуховой системы вслед за первым же курсом введения цитостатика. По клиническим наблюдениям, картина высокочастотной тугоухости по аудиометрии в расширенном диапазоне частот, повышение порога КСВП на тон 8 кГц или депрессия ОАЭ на 10 кГц возникает у 30% пациентов после первого курса химиотерапии с ЦП (сообщение к.б.н. Е.С. Гарбарук) [8]. Схожие изменения отмечены и другими исследователями [8, 20]. В свою очередь, наши экспериментальные данные после однократной «нелетальной» дозы ЦП, показавшие в подостром периоде отодепрессию по КСВП только для 3 из 12 ушей (в 25% случаев), соответствуют клиническим данным. При дальнейшем совершенствовании модели ЦО на крысах Wistar целесообразно учитывать известные способы снижения общей токсичности: применять введение в дополнительном объеме растворителя, многократное (двукратное и трехкратное) введение малых доз (от 1 мг/кг до 4 мг/кг), увеличивать интервал между введениями.

Помимо применения стратегии «нелетального» дизайна не менее важным условием получения специфического повреждения улитки в результате ЦО становится наличие приборного обеспечения, позволяющего выявлять депрессию функционального состояния слухового анализатора на ранних этапах [13, 15]. Речь о технической возможности анализировать аудиологические параметры на ультразвуковых частотах, которые у крыс относятся к видоспецифичному диапазону слуховой чувствительности [21, 22]. Дизайны получения ЦО с минимальными дозами препарата (1 мг/кг) применялись именно при таких диагностических возможностях [1, 13]. В дальнейшем мы оценим качество модели ЦО при дизайне, приближенном к условиям клинических протоколов, например при двукратном введении ЦП в субтоксичных дозах (4—5 мг/кг) с интервалом 14 дней [23].

Крысы стока Wistar — реальный и удобный объект для моделирования цисплатиновой ототоксичности. Аудиологическими проявлениями при нелетальной дозе цисплатина 6 мг/кг становятся снижение амплитуды продукта искажения отоакустической эмиссии в диапазоне высоких частот (10 кГц) и повышение порога слуха до 15 дБ, уменьшение амплитуды II пика по коротколатентным слуховым вызванным потенциалам на ультразвук (30 кГц). Отсутствие летальности в отдаленном периоде, биохимических проявлений нефротоксичности, последующее восстановление массы указывают на получение специфического сенсоневрального повреждения слухового анализатора с патогенезом цисплатиновой ототоксичности и без дополнительного участия в повреждении факторов общетоксического характера.

Таким образом, наше наблюдение показывает, что корректное моделирование цисплатиновой ототоксичности в значительной степени определяется не столько видом экспериментального животного, сколько применением дизайна, наиболее соответствующего условиям химиотерапии у человека (умеренной дозы, кратного интервального введения). Имеет также значение наличие приборного обеспечения, позволяющего проводить аудиометрию по коротколатентным слуховым вызванным потенциалам в ультразвуковом («речевом» для крыс) диапазоне частот. Чем выше возможность приборов генерировать тон подачи и анализировать его, тем более специфичное повреждение можно выявлять, используя минимальные, наиболее приближенные к клиническим протоколам дозы.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда и Санкт-Петербургского научного фонда (проект № 26-15-20006; https://rscf.ru/project/26-15-20006/).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.