Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) представляет группу клональных заболеваний миелоидной ткани, характеризующихся нарушением дифференцировки и созревания гемопоэтических клеток с накоплением значительной массы незрелых (бластных) клеток (БК) преимущественно в костном мозге (КМ) [1, 2]. Отличительным признаком ОМЛ является выраженная морфологическая, иммунологическая и молекулярно-генетическая гетерогенность лейкозных клеток. Вариабельность ОМЛ отражена в классификации ВОЗ органов кроветворной и лимфоидной тканей [3, 4].

Согласно последней версии классификации ВОЗ (2008) выделяют 4 группы ОМЛ: 1) с характерными генетическими изменениями; 2) с дисплазией нескольких ростков; 3) связанный с предшествующей терапией; 4) не подпадающий под признаки перечисленных групп. По сравнению с версией от 2001 г. в группе ОМЛ с повторяющимися молекулярно-генетическими аберрациями, которые сопряжены с определенными морфологическими находками и ассоциированы с характерным клиническим течением, число вариантов увеличено за счет таких аберраций, как транслокация t(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214, инверсия inv(3)(q21q26.2)/RPN1-EVI1.

Расширены также диагностические критерии для ОМЛ с признаками дисплазии посредством добавления к типичным морфологическим находкам цитогенетических маркеров, имеющих вид сбалансированных и несбалансированных перестроек, таких как делеция и моносомия 7-й хромосомы, моносомия 5-й хромосомы, делеция del(11q) и другие аберрации [4].

Вместе с тем, несмотря на принципиальную роль хромосомных аберраций в формировании клинико-гематологического фенотипа ОМЛ и активное манипулирование цитогенетическими изменениями в классификационных системах, необходимо отметить следующее. Во-первых, повреждения в кариотипе, которые позволяют прогнозировать течение заболевания, имеются лишь у некоторых больных ОМЛ (около 40% больных ОМЛ имеют нормальный кариотип). Так, CBF (core binding factor) варианты с транслокацией t(8;21) и инверсией inv(16) составляют от 10 до 15% всех случаев ОМЛ [5-7]. Во-вторых, в рамках классификации ВОЗ существует значительная группа ОМЛ без дополнительных характеристик.

Отсутствие хромосомных аберраций у больных ОМЛ объясняет повышенный интерес к молекулярно-генетическим повреждениям, которые могут 1) быть непосредственно задействованы в лейкозогенезе; 2) принимать участие в формировании клинико-гематологической картины; 3) влиять на эффективность стандартной цитостатической терапии; 4) рассматриваться как перспективные «мишени» для терапевтического воздействия. Такими повреждениями являются мутации генов FLT3, NPM1 и CEBPA.

Согласно рекомендациям European LeukemiaNet изучение статуса перечисленных генов способствует более четкому распределению по группам риска больных ОМЛ с нормальным кариотипом. Так, случаи с единичной мутацией гена NPM1 или гена CEBPA отнесены в группу благоприятного прогноза. Напротив, мутация FLT3-ITD сопровождается ухудшением прогноза независимо от статуса гена NPM1. Наличие у больного ОМЛ с нормальным кариотипом мутации FLT3-ITD дает основание определить его в группу с промежуточным-1 риском [8], хотя, по мнению E. Estey [9], больного с мутацией FLT3-ITD следует относить к группе промежуточного-2 риска.

Одновременно рассматривается вопрос о возможном включении ОМЛ с одиночной мутацией гена NPM1 или CEBPA в группу с повторяющимися генетическими повреждениями в качестве новых самостоятельных вариантов [4]. Это неудивительно, так как ряд авторов продемонстрировали клинико-гематологическую однородность больных ОМЛ с мутацией гена NPM1 [10-12]. Установлено, что мутация гена NPM1 встречается преимущественно у взрослых больных de novo ОМЛ, БК которых чаще всего имеют моноцитарную природу, нормальный кариотип и практически не экспрессируют антиген CD34. Мутация обнаруживается во всех лейкозных клетках и отличается стабильностью. Случаи ОМЛ с мутацией гена NPM1 имеют уникальный профиль экспрессии генов, отличительными признаками которого являются снижение активности гена CD34, повышение активности генов группы HOX, а также дисрегуляция микроРНК, в частности активация miR-10a и miR-10b. Больные ОМЛ с изолированной мутацией NPM1 обычно хорошо отвечают на индукционные курсы терапии и имеют относительно благоприятный прогноз.

Что касается случаев ОМЛ с мутацией FLT3-ITD, то данные, представленные разными авторами, не позволяют сделать окончательное заключение об однородном составе этой группы из-за противоречивого характера результатов. Тем не менее проблема имеет несомненную практическую актуальность, так как обнаружение мутации FLT3-ITD сопряжено с крайне неблагоприятным течением большинства случаев ОМЛ [13]. Обусловлено ли снижение эффективности цитостатической терапии клиническими показателями (пол, возраст), гематологическими параметрами (лейкоцитоз, характер морфологических изменений БК, вариант ОМЛ), особенностями иммунофенотипа лейкозных клеток, дополнительными биологическими повреждениями или наличием только мутации FLT3-ITD, неясно.

Цель данного исследования - выявить особенности de novo ОМЛ с мутацией FLT3-ITD. Для этого запланировано решение 2 задач. Во-первых, оценить вариабельность морфологических и цитогенетических показателей у больных ОМЛ с мутацией FLT3-ITD. Во-вторых, установить, насколько однородным является состав группы больных ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD по данным отдельных гематологических показателей и изучения иммунофенотипа БК.

Результаты обследования больных ОМЛ получены из базы данных гематологической клиники, клинико-гематологической и молекулярно-генетической лаборатории, а также лаборатории иммуногематологии.

Диагноз ОМЛ устанавливали по критериям классификации ВОЗ [3, 4].

Морфологические препараты КМ окрашивали по Паппенгейму. Для дифференцированного подсчета клеточного состава миелограммы анализировали не менее 500 клеток.

Исследование кариотипа осуществляли по стандартному GTG-методу. В отсутствие хромосомных аберраций у больных ОМЛ с созреванием БК дополнительно проводили FISH-исследование для выявления транслокации t(8;21).

Мутационный статус генов FLT3 и NPM1 изучали методом полимеразной цепной реакции тотальной геномной ДНК [13].

Иммунофенотипирование БК КМ проводили в пятицветном анализе на лазерном проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 («Beckman Coulter», США) с использованием панели моноклональных антител («Beckman Coulter», США), меченных разными флуорохромами (FITC, PE, ECD, Pc-5, Pc-7), к поверхностным и внутриклеточным дифференцировочным антигенам миеломоноцитарного и лимфоидного ряда: CD45, CD34, HLA-DR, CD38, CD117, CD33, CD13, CD11c, CD9, CD14, CD64, CD15, CD16, CD56, СD1a, CD2, CD3,CD5, CD7, CD4, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD79a, MPO, TdT.

Для выполнения поставленных задач сформулированы критерии включения, на основании которых осуществляли отбор больных из баз данных. Общими критериями для всех больных были de novo ОМЛ без предшествующей цитостатической терапии, кроме приема гидроксимочевины, возраст 18 лет и старше, наличие доступной информации о результатах изучения миелограмм и исследования кариотипа.

Для решения второй задачи потребовалось выполнение дополнительных условий: 1) исключение из общей группы пациентов больных ОМЛ с хромосомными аберрациями независимо от их характера; 2) иммунофенотипирование БК КМ с обязательным определением экспрессии антигенов HLA-DR, CD7, CD34; 3) доступность результатов исследования цельной крови и мазков периферической крови (ПК) с дифференцированным подсчетом лейкоцитарной формулы, проведенного во время верификации диагноза; 4) отсутствие мутации гена NPM1.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Excel и Statisticа. Различие между отдельными показателями принимали достоверным при р<0,05.

За период с 2005 г. по декабрь 2012 г. в молекулярно-генетической лаборатории РНИИГТ исследование мутационного статуса генов NPM1 и FLT3 выполнено 101 больному ОМЛ.

Мутация FLT3-ITD обнаружена у 21 больного, соответствующего критериям включения в исследование. Среди них 11 (52,4%) мужчин и 10 (47,6%) женщин, соотношение 1,1:1,0. Медиана возраста больных составила 56 лет (от 32 до 76 лет).

Распределение по вариантам классификации ВОЗ было следующим: 2 больных с транслокацией t(15;17) (острый промиелоцитарный лейкоз), 1 - без созревания БК, 11 - с созреванием БК, 4 больных острым миеломонобластным лейкозом, 2 - острым монобластным лейкозом и 1 - эритромиелозом. Таким образом, в большинстве случаев БК имели миелоидную или моноцитарную природу - у 12 (57,1%) и 6 (28,6%) больных соответственно.

По результатам цитогенетического исследования обнаружено, что у 13 (61,9%) больных с мутацией FLT3-ITD имелся нормальный кариотип. В остальных случаях обнаружены цитогенетические поломки, представленные разными вариантами хромосомных аберраций. Транслокация t(15;17)(q22;q21) имелась у 2 больных. Одиночные аберрации, включая трисомию 8-й хромосомы и делецию del(9q)(q22), верифицированы у 2 пациентов. У 3 больных выявлены двойные аберрации и у 1 больного - множественные поломки. Необходимо отметить, что у 3 больных с ≥2 хромосомными аберрациями характер повреждений соответствовал критериям моносомного кариотипа [14].

Одновременно с мутацией FLT3-ITD у 3 пациентов обнаружена мутация гена NPM1.

Отдельному анализу подвергнуты данные обследования больных ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD. Заданным критериям включения соответствовали 10 больных. Группу сравнения составили 18 больных.

Возраст больных de novo ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией гена FLT3-ITD был от 23 до 76 лет, медиана - 62 года. При этом 6 (60%) больных были старше 60 лет.

Заболевание представлено случаями с созреванием БК (у 7 больных), острым миеломонобластным лейкозом (у 2) и острым монобластным лейкозом (у 1).

На период верификации диагноза в анализе ПК+ выявлены следующие показатели: л. 23,1±19,6·10⁹/л (2,9-69,6·10⁹/л), бл. 43,1±28,1% (0-95%), Hb 86,7±13,1 г/л (55-118 г/л), тр. 52,0±29,8·10⁹/л (13,0-178,0·10⁹/л).

В пунктате КМ среднее содержание миелокариоцитов составило 116,2±87,4·10⁹/л (10,0 - 380,0·10⁹/л). Количество БК и эритроидных клеток в миелограмме достигало 60,5±12% (27,4-77,1%) и 13,8±6% (5,2-26,6%) соответственно.

Медиана возраста больных контрольной группы была 49 лет (от 19 до 76 лет) и достоверно не отличалась от возраста больных ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD (р=0,164).

При сравнении результатов иммунофенотипирования БК у больных с мутацией гена FLT3-ITD и без таковой не выявлено значимых различий по средним показателям экспрессии CD34 и HLA-DR (p=0,472 и р=0,347 соответственно). Различие по средним показателям экспрессии CD7 также было недостоверным, однако наблюдалась тенденция к увеличению экспрессии данного антигена на БК больных с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD (р=0,061; см. таблицу).

Поэтому дополнительно проанализировано число больных, у которых на БК экспрессия отдельных антигенов превышала 20% (диагностически значимая величина). Между группами с мутацией FLT3-ITD и без нее не выявлено различий по числу больных с высокой экспрессией CD34 - 90% против 83,3% (р=0,635). В то же время больных с высокой экспрессией HLA-DR и CD7 было значительно больше в группе с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD - 50% против 5,6% (р=0,007 и 100% против 55,6%; р=0,014; см. таблицу).

Одним из способов повышения выживаемости больных ОМЛ является адаптация интенсивности цитостатической терапии к варианту прогноза [9]. Для распределения больных ОМЛ на группы риска могут быть использованы клинические, гематологические и морфологические показатели. В то же время, как продемонстрировано в многочисленных исследованиях, наиболее информативным фактором риска на этапе диагностики ОМЛ является кариотип [15, 16]. Обнаружено, что отдельные хромосомные аберрации, такие как инверсия inv(16), транслокация t(8;21) и транслокация t(15;17), ассоциированы с относительно благоприятным прогнозом независимо от отсутствия или наличия дополнительных цитогенетических аномалий [5, 17]. Напротив, выявление так называемого моносомного кариотипа сопряжено с крайне неблагоприятным течением ОМЛ даже в случае проведения аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [18, 19].

Число хромосомных аберраций, для которых установлен прогностический потенциал, постоянно увеличивается. Вместе с тем остается проблема больных de novo ОМЛ с нормальным кариотипом. В некоторой степени прогнозировать течение такого варианта ОМЛ можно по скорости элиминации БК из ПК в период индукционной терапии [20], а также клеточности КМ и количеству БК в костномозговом пунктате на 14-й день постиндукционного периода [21]. Однако наибольший практический интерес представляют молекулярно-генетические повреждения: мутации или нарушения экспрессии отдельных генов. Это обу­словлено тем, что большинство генетических аберраций могут не только использоваться для определения прогноза, но также быть маркерами объема резидуальных лейкозных клеток и «мишенями» для так называемой таргетной терапии. К таким повреждениям относятся мутации генов NPM1 и FLT3, определение которых включено в большинство алгоритмов лечения больных de novo ОМЛ [8, 9].

Рецептор FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3) является одним из представителей суперсемейства трансмембранных рецепторных тирозинкиназ. Экспрессия FLT3 тирозинкиназы обнаружена преимущественно в стволовых кроветворных клетках CD34⁺, в лимфоцитах тимуса и лимфатических узлов. Структуру FLT3 можно представить в виде 2 частей: рецепторная часть расположена на клеточной мембране и состоит из 5 иммуноглобулиновых доменов, которые связываются с лигандом. Внутренняя часть состоит из подмембранного (юкстамембранного) домена и 2 каталитических (киназных) доменов. Связывание рецептора с лигандом ведет к его димеризации, фосфорилированию и связыванию с внутриклеточными Src-киназами, что приводит к запуску каскада реакций по MAP-киназному пути и экспрессии генов, отвечающих за пролиферацию, рост и дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток.

Рецептор FLT3 кодируется геном FLT3, который состоит из 993 аминокислот [22, 23]. Обнаружено несколько приобретенных мутаций гена FLT3, которые вовлечены в лейкозогенез. Для рецептора FLT3 характерны 2 основных типа мутаций - внутренняя тандемная дупликация (internal tandem duplication FLT3-ITD) и точечная мутация в «А-петле» (FLT3-TKD). FLT3-ITD встречается примерно у 15-35% больных ОМЛ, размер инсерции может составлять от 3 до 400 п.о. Наличие FLT3-ITD ассоциировано с быстрым прогрессированием заболевания, устойчивостью к стандартной терапии и, следовательно, с неблагоприятным прогнозом как у детей, так и у взрослых. Так P. Kottaridis и соавт. [24] в случае обнаружения мутации FLT3-ITD выявили снижение частоты полных ремиссий - ПР (78% против 84% у больных без мутации; р=0,05), а также 5-летней общей выживаемости (32% против 44%; р<0,001) и безрецидивной выживаемости (23% против 39%; р<0,001) из-за высокой частоты рецидивов (64% против 44%; р<0,001). В то же время, по данным S. Schnittger и соавт. [25], при выявлении мутации FLT3-ITD следует ожидать снижения «бессобытийной» выживаемости, тогда как частота ПР и медиана общей выживаемости не зависят от мутационного статуса гена FLT3.

Различие результатов исследований может быть обусловлено многими факторами. Так, установлено прогностическое значение размера инсерционной последовательности у FLT3-ITD-положительных больных: более крупный размер инсерционной последовательности ассоциирован с высокой вероятностью рецидива [26]. Различные размер, вид, аллельная нагрузка мутаций в подмембранном домене могут иметь уникальную биологическую и клиническую значимость, тем самым внося дополнительную сложность в использование FLT3-ITD в качестве прогностического маркера [26, 27].

Вместе с тем следует признать, что более важным является состав анализируемых групп в исследованиях, который различается не только по возрасту больных и их коморбидности, но и по цитоморфологическим вариантам ОМЛ, вариантам кариотипа, сопутствующим генетическим повреждениям. Необходимо напомнить, что большинство из перечисленных параметров сами являются независимыми прогностическими факторами. Так, М. Breccia и соавт. [28] выявили, что наряду с мутацией FLT3-ITD негативное влияние на результаты лечения оказывают предшествующий миелодиспластический синдром, индекс коморбидности, рассчитанный по шкале Charlson, и лейкоцитоз >100·10⁹/л. По данным Н. de Jonge и соавт. [29], гиперлейкоцитоз >100·10⁹/л сопряжен с наихудшими результатами лечения в случаях, характеризующихся промежуточным вариантом кариотипа и генотипом NPM1⁺/FLT3-ITD⁺.

В то же время в отличие от слитных генов BCR/ABL и PML-RARá мутация FLT3-ITD не ассоциирована с каким-то одним уникальным клинико-гематологическим фенотипом ОМЛ. Напротив, она может быть находкой, независимой от морфологических и цитогенетических изменений. При этом у больных острым промиелоцитарным лейкозом и ОМЛ с нормальным кариотипом и моноцитарной природой БК вероятность обнаружения мутации FLT3-ITD выше, чем при других вариантах ОМЛ. И хотя вопрос о прогностическом значении мутации у больных острым промиелоцитарным лейкозом остается нерешенным, в большинстве исследований продемонстрировано отсутствие негативного влияния FLT3-ITD на эффективность лечения [30-32], что также может отражаться на показателях выживаемости в группах, специально не отобранных больных.

Результаты собственного исследования подтверждают выраженную гетерогенность de novo ОМЛ с мутацией FLT3-ITD по клинико-гематологическим и молекулярно-генетическим характеристикам. Единственным параметром, который регулярно встречается у большинства больных ОМЛ с мутацией FLT3-ITD, является лейкоцитоз. Однако этого критерия явно недостаточно для формирования самостоятельной группы.

Оправданным представляется использовать наличие мутации FLT3-ITD для создания отдельного прогностического варианта в рамках ОМЛ с четко очерченными клинико-гематологическими и цитогенетическими показателями, каким является ОМЛ с нормальным кариотипом.

Мутация FLT3-ITD обнаруживается у 20-40% больных de novo ОМЛ с нормальным кариотипом [24, 27]. Отличительным признаком этой категории больных, как и больных ОМЛ с мутацией FLT3-ITD в целом, является более высокое количество лейкоцитов в ПК, чем у больных без мутации: 44,8-68,0·10⁹ и 12,5-27,0·10⁹/л соответственно [33, 34]. Предполагается, что причиной лейкоцитоза является конституциональная активация рецептора тирозинкиназы, приводящая к автономной, независимой от цитокинов, пролиферации клеток [23]. По данным F. Ostronoff и соавт. [35], лейкоцитоз более 20,0·10⁹/л может рассматриваться как фактор, позволяющий предполагать наличие мутации FLT3-ITD. Однако лейкоцитоз >20,0·10⁹/л констатируется у 58% больных de novo ОМЛ и только у 32% больных ОМЛ с мутацией FLT3-ITD, причем в группе со всеми вариантами кариотипа [29].

В связи с этим значительный интерес представляет изучение дополнительных, негематологических, факторов, позволяющих достаточно полно охарактеризовать случаи de novo ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD. Как установлено, отличительной особенностью больных ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD является высокая экспрессия антигена CD7 на БК [34, 36, 37]. Так V. Rausei-Mills и соавт. [37] при обследовании 31 больного ОМЛ обнаружили аберрантную экспрессию CD7 у 11 из 15 больных с мутацией FLT3-ITD и у 1 из 16 пациентов без мутации: 73 и 6% соответственно (р<0,001). Достоверное различие по аберрантной экспрессии CD7 обнаружено и P. Chauhan и соавт. [34]: 32% с мутацией и 8% без мутации (р<0,01). Различие по числу случаев с высокой экспрессией антигена CD7, как и различие по экспрессии других антигенов, включая HLA-DR и CD34, между разными исследованиями объясняется числом обследованных больных. Так, P. Chauhan и соавт. [34] проанализировали данные 136 больных, из которых у 27 выявлена мутация FLT3-ITD. Не менее важным является различие по возрастному составу больных, также как по морфологическим вариантам ОМЛ.

Вероятно, этими же причинами обусловлены и данные, полученные авторами статьи: высокая экспрессия антигена CD7 обнаружена у всех 10 больных с мутацией FLT3-ITD. Как установлено F. Schneider и соавт. [38] , с возрастом у больных ОМЛ с нормальным кариотипом распространенность мутации FLT3-ITD снижается. В проведенном исследовании, хотя различие недостоверно, медиана возраста больных с мутацией составила 62 года, тогда как без мутации - 49 лет. Нельзя исключить, что экспрессия антигена CD7 у больных de novo ОМЛ может не только быть сопряжена с мутацией FLT3-ITD, но и отражать такие биологические особенности, как существование ранее не распознанного миелодиспластического синдрома, заболеваемость которым, как известно, увеличивается с возрастом.

Несмотря на различие в показателях, собственные данные подтверждают факт аберрантного иммунофенотипа БК больных ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD [34, 36, 37].

Существует мнение, что высокая экспрессия антигена CD7 на БК больных ОМЛ свидетельствует о возникновении лейкоза из ранних коммитированных гемопоэтических клеток. Подтверждением этой гипотезы может быть и другая находка проведенного анализа: высокая частота экспрессии антигена HLA-DR на БК больных с мутацией FLT3-ITD.

Полученные данные дают основание сделать вывод, что ОМЛ с нормальным кариотипом и мутацией FLT3-ITD представляет группу, однородную по целому ряду гематологических показателей и биологических характеристик лейкозных клеток. Для окончательного подтверждения данного тезиса необходимо дальнейшее накопление материала, который позволил бы выявить возможную ассоциацию мутации FLT3-ITD с возрастом, профилем экспрессии генов и эпигенетическими повреждениями, эффективностью стандартных индукционных и консолидирующих курсов терапии.

Немаловажным итогом проведенного исследования является также возможность прогнозировать вероятность обнаружения у больных de novo ОМЛ с нормальным кариотипом мутации FLT3-ITD. Как свидетельствуют собственные данные и данные литературы, маркерами возможной детекции мутации FLT3-ITD является лейкоцитоз в сочетании с аберрантной экспрессией антигена CD7 и/или повышенной экспрессией HLA-DR на БК. Целесообразность получения данной информации обусловлена появлением лекарственных препаратов, обладающих анти-FLT3-активностью [39, 40]. Учитывая, что резистентность БК больных ОМЛ с мутацией FLT3-ITD к цитостатическим препаратам не сопряжена с активностью гена множественной лекарственной резистентности [41-43], методом профилактики рецидива и улучшения безрецидивной выживаемости больных ОМЛ можно считать раннее назначение ингибиторов FLT3.

Обязательным условием диагностики ОМЛ является проведение комплексного обследования больных с изучением иммунофенотипической характеристики БК, кариотипа и мутационного статуса отдельных генов. Результаты проведенных исследований дают основание установить природу БК и тем самым выбрать соответствующую схему лечения. Вместе с тем тщательный анализ результатов лабораторных исследований по мере их выполнения позволяет в ранние сроки предположить наличие дополнительных к возрасту и количеству лейкоцитов в ПК неблагоприятных факторов прогноза, например мутации FLT3-ITD, и тем самым выбрать оптимальную по интенсивности цитостатическую терапию.