Изучение прегабалина и лоразепама при совместном присутствии для целей химико-токсикологического исследования

Прегабалин является структурным аналогом гамма-аминомасляной кислоты. Препарат синтезирован в 2004 г., производится американской корпорацией под торговым названием «Лирика». Он относится к фармакологической группе противосудорожных средств, применяется в психиатрии и неврологии. Прегабалин эффективен при эпилепсии, судорожных припадках, неврологической боли, генерализованных тревожных расстройствах [1, 2]. Лицензирован для терапии периферической и центральной нейропатической боли, а также в качестве комплексной терапии лиц с фокальными эпилептическими припадками [3]. В наркологии прегабалин используется при лечении лиц с зависимостью от психоактивных веществ (этанол, бензодиазепины) [4].

Применяют прегабалин как в монотерапии, так и в комбинациях с другими анксиолитиками, в частности лоразепамом.

Лоразепам — бензодиазепиновый анксиолитик кратковременного действия. В основе структуры лоразепама лежит 5-арил-1,4-бензодиазепин. Лоразепам синтезирован в 1963 г. для создания препарата с более выраженной транквилизирующей активностью. Впервые поступил в продажу в 1977 г. в США. Лоразепам до сих пор остается одним из наиболее применяемых и назначаемых бензодиазепинов в США и странах Западной Европы, включен в список наиболее необходимых лекарств Всемирной организацией здравоохранения [5, 6]. Единственным доступным на российском рынке препаратом лоразепама является Лорафен от фирмы «ПольфаТархомин», выпускаемый в виде таблеток по 1 и 2,5 мг.

Наряду с положительным терапевтическим эффектом прегабалин и лоразепам в определенных условиях (при передозировке, злоупотреблении, повышенной чувствительности организма) оказывают токсическое действие на организм человека. Длительное применение прегабалина и лоразепама вне зависимости от комбинации их между собой способно вызвать психологическую и физическую зависимость. В наиболее тяжелых случаях отравлений развивается кома [4, 5].

Возрастает число случаев немедицинского применения прегабалина и лоразепама, растет количество обращений лиц, принимавших какой-либо из этих двух препаратов, за амбулаторной или стационарной помощью. В связи с этим актуальна проблема разработки методик химико-токсикологического анализа (ХТА) отравлений данными препаратами.

Цель исследования — разработка способов обнаружения и изолирования прегабалина и лоразепама в моче пациентов при их совместном присутствии.

Химические свойства препаратов являются основой для составления схемы изолирования и обнаружения токсикантов (табл. 1).

При пероральном введении прегабалин поглощается довольно быстро, достигая пиковой плазменной концентрации в течение 1 ч. Пероральная биодоступность прегабалина составляет 90% и более независимо от дозы. У человека объем распределения прегабалина при пероральном приеме составляет примерно 0,56 л/кг. Препарат не связывается с белками плазмы, практически не подвергается метаболизму. После приема меченого прегабалина примерно 98% радиоактивной метки определяется в моче в неизменном виде. Основным метаболитом является N-метилпрегабалин, доля которого, обнаруживаемая в моче, составляет 0,9% от дозы. Не отмечены признаки рацемизации S-энантиомера прегабалина в R-энантиомер [7—9].

Лоразепам из-за слабой жирорастворимости относительно медленно всасывается при пероральном применении, однако активно связывается с белками и метаболизируется в фармакологически неактивные метаболиты. Конъюгация с глюкуроновой кислотой является основным путем метаболизма лоразепама: 70—75% от введенной дозы выводится в виде лоразепама глюкуронида с мочой. Весь препарат полностью выводится из организма в течение 1 нед после назначения последней дозы [2, 9].

Объектами исследования служили субстанция прегабалина «Sigma—Aldrich» (США) с чистотой 99,998%, таблетки Лорафен 2,5 мг, пробы мочи добровольцев, не содержащие исследуемые препараты.

Пробоподготовка. Некоторые условия пробоподготовки изучаемых аналитов из биологических жидкостей с помощью жидкость-жидкостной и твердофазной экстракции приведены в литературе [9, 10]. Мы применили следующие методики изолирования препаратов из мочи. Изолирование лоразепама: к 10 мл мочи добавляли NaOH до рН 10,0, экстрагировали дважды хлороформом двойным объемом. Изолирование прегабалина: к 10 мл мочи добавляли 1 г натрия хлорида, перемешивали; добавляли 5 мл изобутанола, встряхивали; центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин; отбирали верхний слой.

Для обнаружения лоразепама в объектах после пробоподготовки использовали реакцию диазотирования и образования азокрасителя после кислотного гидролиза (исследование по аминобензофенонам). Аликвоту мочи, содержащую лоразепам, заливали 6н. НCl и нагревали при температуре 140—145 ˚С в течение 60 мин. Из гидролизата экстрагировали органическим растворителем при рН 6,0—8,0. Далее проводили диазотирование 5% раствором натрия нитрита и азосочетание в щелочной среде с β-нафтолом (бордово-красное окрашивание), с резорцином (желто-оранжевое окрашивание) или в умеренно кислой среде с N-α-нафтилэтилендиамином (красно-фиолетовое окрашивание).

Для предварительного обнаружения прегабалина как производного аминокислоты использовали нингидриновую пробу: при добавлении к 1 мл полученного после извлечения экстракта свежеприготовленного 1% раствора нингидрина в этаноле и нагревании в токе теплого воздуха появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Данные реакции являются неспецифичными, поэтому использовать их необходимо в качестве предварительного исследования.

Кроме того, в качестве предварительных испытаний была использована тонкослойная хроматография.

Предварительно изучали хроматографическую по-движность исследуемых веществ в растворителях. На основании этих данных, физико-химических свойств аналитов и широко используемых в химико-токсикологическом анализе систем растворителей выбрали и исследовали 4 системы растворителей:

S₁. Толуол—ацетон—этанол—25% аммиак (45:45:7:3).

S₂. Изопропанол—ацетон—25% аммиак—вода (22:25:4:7).

S₃. Циклогексан—толуол—ацетон (75:15:10).

S₄. Хлороформ—ацетон (40:20).

Хроматографирование проводили на пластинках Sorbfill ПТСХ-АФ-В-УФ и Sorbfill ПТСХ-П-А (неподвижная фаза).

На линию старта наносили по 10 мкл рабочих образцов лоразепама и прегабалина в концентрации 0,1 мг/мл в этаноле. Хроматографирование в каждой системе растворителей проводили в шести повторностях с последующей статистической обработкой полученных результатов.

В качестве проявителей использовали:

1. УФ-лучи при длине волны 254 нм;

2. Пары йода (универсальный проявитель);

3. Реактив Драгендорфа.

Результаты ТСХ-скрининга лоразепама и прегабалина представлены в табл. 2.

Данные хроматографической подвижности токсикантов в системах S₁ и S₂ на пластинках Sorbfill ПТСХ-АФ-В-УФ показывают эффективную разделяющую способность и обнаружение лоразепама и прегабалина методом ТСХ-скрининга.

Результаты исследования образцов мочи, не содержащих аналиты, исследовали на пластинках Sorbfill ПТСХ-АФ-В-УФ (табл. 3).

Из данных табл. 3 видно, что соэкстрактивные вещества мочи после изолирования «холостых» проб по предложенным для лоразепама и прегабалина методикам не оказывают влияния при ТСХ-скрининге токсикантов.

Методом ТСХ исследовали образцы мочи, содержащие лоразепам и прегабалин (табл. 4).

Анализ данных, представленных в табл. 4, показывает, что при ХТА прегабалина и лоразепама в моче система S₂ подходит для двух типов пластинок, а систему S₁ целесообразно использовать только для пластинки Sorbfill ПТСХ-АФ-В-УФ.

В качестве подтверждающих методов исследования (согласно Приказу М.З. РФ № 346н [11]) применили спектрофотометрию (в УФ- и ИК-областях) и метод ГХ-МС. Метод ВЭЖХ на данном этапе не использовали, хотя он перспективен, особенно при анализе прегабалина, и применяется в России и за рубежом [12, 13].

Исследования проводили с помощью спектрофотометра марки СФ-103 (Россия). Полностью автоматическое устройство позволяет в соответствии с заданной программой Spectr-1.0 for Windows 8 получать спектральные характеристики и спектры изучаемых лекарственных средств.

Измеряли спектральные характеристики в УФ-области поглощения лоразепама при длине волны в пределах 200—360 нм и концентрации препарата 10 мкг/мл с интервалом сканирования 1 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Характерные спектры для лоразепама наблюдали при длине волны от 232 нм. Для прегабалина при концентрации 10 мкг/мл в интервале поглощения 300—600 нм отметили характерные спектры с максимумами 402 и 572 нм в видимой области спектра. Для получения спектра прегабалина в видимой области получали окрашенное соединение путем реакции с добавлением окисленного 2,4-динитрофенилгидразина [14]. В УФ-области не наблюдали характерного спектра (отсутствие выраженного максимума и минимума) для прегабалина (рис. 1).

Исследование проводили на инфракрасном спектрометре марки Nicolet Avatar 330FT-IR (США) с типом детектора DTGS при температуре воздуха 21,5 °С и влажности воздуха 16,6% (термогидрометр ИВА-6; Россия). После проведенной пробоподготовки получали ИК-спектры образцов извлечений из мочи прегабалина и лоразепама (рис. 2).

Мочу здоровых добровольцев смешивали и для исследования использовали модельную смесь (моча + исследуемые вещества). Образец мочи объемом 10 мл центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин, далее 100 мкл пробы переносили в виалу, упаривали досуха в токе инертного газа (гелий) при комнатной температуре. Затем к сухому остатку добавляли дериватизирующий агент «mix» (смесь 10 мг аммония иодида, 5 мл MSTFA и 30 мкл этилмеркаптана) и выдерживали в термостате при температуре 80 ˚С в течение 30 мин в герметично закрытой виале. После охлаждения добавляли 50 мкл ацетонитрила, переносили в прибор и анализировали.

ГХ-МС анализ проводили на газовом хроматографе Trace GC Ultra с масс-селективным детектором DSQ II и автоинжектором TriPlus (Италия), оборудованным хроматографической кварцевой капиллярной колонкой НР-5MS фирмы «Agilent» (США) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной фазы 0,25 мкм (5% фенилметилполисилоксан). Газ-носитель — гелий, скорость потока газа-носителя через колонку 1,2 мл/мин, линейная скорость 41 см/с. Температура испарителя 280 °C. Режим программирования температуры термостата колонки: 115 °C — 3 мин, от 115 до 280 °C нагревали со скоростью 15 °С/мин и выдерживали 12 мин при конечной температуре. Общее время анализа 26 мин. Ввод пробы осуществляли в режиме без деления потока (splitless). Объем вводимой пробы 1 мкл, температура квадруполя 150 °C, температура источника ионов 230 °C. Использовали ионизацию электронным ударом при 70 эВ в режиме сканирования полного ионного потока (SCAN) в диапазоне от 50 до 600 m/z.

На хроматограмме (рис. 3)

1. Предложенные подходы к пробоподготовке биообъекта и обнаружению лоразепама и прегабалина позволяют с достаточно высокой вероятностью определять токсиканты при их совместном присутствии. Эти подходы могут быть использованы при анализе мочи в случаях острых отравлений. Они пригодны при химико-токсикологическом анализе в качестве предварительного и подтверждающего исследования на наличие злоупотребления указанными лекарственными средствами.

2. Предложены 4 системы растворителей для тонкослойной хроматографии: толуол—ацетон—этанол—аммиак (45:45:7:3), изопропанол—ацетон—аммиак—вода (22:25:4:7), циклогексан—толуол—ацетон (74:15:10) и хлороформ—ацетон (40:20).

3. Представлены характеристики спектров лоразепама и прегабалина в УФ- и видимой области спектра по максимумам 232, 402 и 572 нм соответственно.

4. Предложены условия проведения анализа с помощью ГХ-МС для обнаружения лоразепама и прегабалина, позволяющие достоверно разделить пики этих препаратов на хроматограмме.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.