Сравнительный анализ методик определения фосфатидилэтанола в крови как биомаркера злоупотребления алкоголем

Человечество всегда сталкивалось с проблемой злоупотребления алкоголем, она не утратила своей актуальности и в наши дни. Чрезмерное употребление алкоголя неблагоприятно воздействует на здоровье населения и имеет негативные социальные последствия. Согласно представленному в 2014 г. ВОЗ «Глобальному докладу о положении в области алкоголя и здоровья» в 2012 г. 3,3 млн смертей были обусловлены потреблением алкоголя, что составило 5,9% от всех случаев смертей в мире. Среди мужского населения 7,6 и 4% случаев смерти среди женщин были связаны с алкоголем. Злоупотребление алкоголем повышает риск возникновения более 200 болезней, включая психоневрологические расстройства, онкологические заболевания, цирроз печени и различные виды травм. По данным за 2010 г., Российская Федерация занимала 4-е место в мире по показателю потребления алкоголя на душу населения в возрасте 15 лет и старше, который составил 15,1 л/год [1—3].

Для объективной оценки и мониторинга количества и частоты потребляемого человеком алкоголя используют лабораторные маркеры употребления алкоголя, которые можно разделить на две группы — прямые и непрямые биомаркеры. К непрямым биомаркерам относятся аспартатаминотрансфераза (AСТ), аланинаминотрансфераза (AЛТ), γ-глутамилтрансфераза (ГГТ), карбогидратдефицитный трансферрин (CDT) и средний корпускулярный объем эритроцитов (MCV) [4—6]. Эти биомаркеры образуются в результате воздействия этанола на организм человека, но их содержание может повышаться в результате развития различных патологических процессов, часто не связанных со злоупотреблением алкоголем. Наиболее точным и объективным биомаркером для лабораторной диагностики хронического злоупотребления алкоголем является CDT, специфичность и чувствительность которого составляют 92—97 и 55—90% соответственно [5]. Повышение количества CDT в крови наблюдается только спустя 2 нед после потребления алкоголя в размере 60—80 г/день в течение 7—10 дней, что обусловливает поиск более перспективных биомаркеров для своевременной диагностики злоупотребления алкоголем [7, 8].

К прямым биомаркерам потребления алкоголя относятся метаболиты этанола — этилглюкуронид (EtG) и фосфатидилэтанол (PEth) [4]. EtG накапливается в волосах человека, поэтому данный биомаркер применяют для контроля ремиссии в течение продолжительного времени [9]. В настоящее время активно изучают биомаркер PEth. PEth является глицерофосфолипидом, который образуется в различных тканях в присутствии этанола из эндогенного фосфолипида фосфатидилхолина под действием фосфолипазы D, но накапливается только в эритроцитах. Известно 48 гомологов PEth, однако наиболее часто встречаются PEth 16:0/18:1 (38%) и PEth 16:0/18:2 (24%) [10—12].

Содержание PEth повышается даже при разовом употреблении алкоголя (t_max~8 ч) [13], при этом период его полувыведения составляет 4—10 дней [14—16]. В случаях хронического злоупотребления алкоголем PEth накапливается в крови и может быть определен в течение 28 дней после последнего приема алкоголя несмотря на то, что менее 0,5% потребленного этанола метаболизируется в PEth [17, 18]. Специфичность PEth как биомаркера составляет 100% [17, 18], а чувствительность, согласно исследованиям [17—19], — от 94 до 100%.

Необходимо отметить, что при хранении взятых на анализ проб крови при комнатной температуре или при температуре –20 °С в присутствии этанола происходит образование PEth in vitro, чего не наблюдается в случае хранения проб при 4 °C (до 72 ч) и при температуре –80 °С [20]. В настоящее время единственным официально установленным пороговым значением для выявления злоупотребления алкоголем является 0,3 мкмоль/л (210 нг/мл) PEth в крови, а значение PEth менее 0,05 мкмоль/л (35 нг/мл) характеризует низкий уровень потребления алкоголя [21]. К сожалению, приведенные пороговые значения не основаны на данных исследований о зависимости потребления алкоголя и содержания PEth в крови [4].

Разработаны различные методики количественного определения PEth, позволяющие детектировать суммарное количество PEth или отдельные его гомологи в низких концентрациях [22]. Показано, что количественное измерение суммы PEth 16:0/18:1 и PEth 16:0/18:2 коррелирует лучше с общим содержанием PEth в крови, чем измерение каждого из гомологов в отдельности [23]. Первые методы анализа PEth заключались в проведении тонкослойной хроматографии (ТСХ) [24, 25], затем определение стали проводить методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с испарительным светорассеивающим детектором [19]. Данный метод не позволял отдельно выявить различные гомологи PEth и характеризовался низкой чувствительностью (предел определения LOQ составляет 154 нг/мл).

Многие авторы [4, 14, 23] для анализа PEth в своих исследованиях применяют метод жидкостной хроматографии — тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) с электроспрейной ионизацией. При использовании данного метода LOQ составляет 14—30 нг/мл. Метод ВЭЖХ-МС/MС позволяет идентифицировать и количественно определять отдельные гомологи PEth, однако различные модификации данного метода более чувствительны. Для анализа PEth также можно использовать метод жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией высокого разрешения [12], ВЭЖХ-МС/МС [26] и ультра-ВЭЖХ-МС/MС [27]. Данные методы отличаются высокой чувствительностью, причем минимальное значение LOQ составляет 0,7 нг/мл при проведении анализа PEth с помощью LC-ESI-HRMS.

В опубликованных сообщениях [4, 12, 14, 19, 23, 26—28] PEth выделяют из цельной или гемолизированной крови объемом от 100 до 300 мкл с помощью жидкость-жидкостной экстракции гексаном или гептаном после добавления изопропанола и внутреннего стандарта. Изопропанол добавляют для разрушения клеточных мембран эритроцитов и разрыва связей между белками и липидами, что способствует высвобождению фосфолипидов для последующей экстракции. В качестве внутреннего стандарта используют фосфатидилметанол, фосфатидилпропанол, фосфатидилбутанол и PEth 16:0/18:1, 16:0/18:2 с дейтериевой меткой. Для разделения применяют различные неполярные колонки (Luna, Hypurity, Zorbax XDB), чаще всего длиной 50 мм и диаметром 2,0—4,6 мм [29]. Детектором служат тройной квадруполь (QQQ), ионная ловушка (IT) или гибридный тройной квадруполь с линейной ионной ловушкой (QTrap). Более подробно сравнительный анализ методик определения PEth представлен в таблице.

Для ускорения анализа PEth возможно применение метода неводного капиллярного электрофореза (NACE) с использованием в качестве детектора online ESI-MS. LOQ при данной методике составляет лишь 0,4 мкмоль/л (280 нг/мл) [30]. Большинство предлагаемых методик определения PEth предполагает забор крови из вены. Для выполнения данной процедуры требуется наличие квалифицированного медицинского персонала, а сама венепункция является дорогостоящей и болезненной манипуляцией. С целью упрощения определения PEth предложен метод сухой капли крови (DBS — dried blood spots) [27, 31, 32]. В настоящее время метод успешно применяется для мониторинга ВИЧ-инфекции, употребления наркотиков и скрининга метаболических нарушений у новорожденных [33]. Преимущества данного метода заключаются в меньшей инвазивности по сравнению с венепункцией, повышенной стабильности полученных образцов и отсутствии требований клинических условий. Доказана стабильность PEth в DBS в условиях хранения при температуре –80 °C, а также при хранении в закрывающихся сумках с влагопоглощающим пакетом при комнатной температуре вплоть до 6 мес, что безусловно повышает ценность данной методики с практической точки зрения [27].

В настоящее время различные методики определения содержания PEth начали применять в лабораторно-диагностической практике для отнесения лиц к группам риска по потреблению алкоголя, мониторинга стабильности ремиссии алкоголизма и выявления возможных рецидивов. Определение количества PEth также проводят в судебной психиатрии и для допуска к вождению после лишения прав из-за управления транспортным средством в состоянии алкогольного опьянения [9].

Таким образом, из всех используемых биомаркеров для диагностики злоупотребления алкоголем наиболее перспективным представляется определение содержания PEth в крови ввиду его максимальной специфичности и высокой чувствительности. Оптимальной методикой детектирования PEth можно считать ВЭЖХ-МС/МС в различных модификациях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.