О возможности определения генетической идентичности тканей со злокачественными опухолями, залитыми в парафиновые блоки

В судебно-медицинской практике часто приходится решать вопросы определения генетической идентичности тканей по архивному материалу гистологических лабораторий бюро СМЭ [1]. Иногда в парафиновом блоке важно определить наличие чужеродной ткани («floater»), которая случайно может быть привнесена во время хирургического иссечения образца, в процессе его вырезки, заливки в парафин, микротомии, а также при рутинном окрашивании [2] и в дальнейшем явиться причиной диагностических ошибок. Важно учитывать, что нормальная ткань одного пациента может контаминироваться злокачественной опухолью другого больного, например, при повторном использовании парафина от старых парафиновых блоков [3].

В настоящее время для решения вопроса о генетической идентичности тканей нередко используют тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы — STR (short tandem repeats). Это уникальные повторяющиеся единицы, состоящие из 2—6 нуклеотидных пар [4, 5]. В конце XX века альтернативой STR явились так называемые однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism — SNP) — отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T, G или C) [4].

При соблюдении данных условий вероятность ошибки в случаях молекулярно-генетической идентификации составляет 0,08—1,2% [6], а совпадение геномного профиля сыворотки крови двух разных лиц, не страдающих онкологическими заболеваниями, наблюдается в соотношении 1:18 000 [6, 7]. Считается, что тканевые образцы принадлежат двум разным людям, если у них не совпадает более 33% SNP (до 67% может совпадать) [8]. Некоторые исследователи [9] считают, что даже в тканях со стабильным геномом с помощью SNP нельзя судить о тождестве тканей.

C учетом имеющихся противоречий нет полной гарантии, что результаты выполненного исследования молекулярно-генетической идентификации являются точными [3, 10].

Существует также точка зрения, что использование для генетической идентификации ткани злокачественных опухолей в тестах на отцовство и при диагностике перепутанных образцов ткани, фиксированных в формалине или залитых в парафин, затруднительно и может привести к неправильной интерпретации полученных результатов, особенно если не доступны нормальные ткани [11—13].

Цель исследования — разработка судебно-медицинских критериев оценки пригодности тканей со злокачественными опухолями, залитыми в парафиновые блоки, для молекулярно-генетического исследования по поводу идентичности тканей.

В результате опухолевой генетической нестабильности профили STR и SNP опухоли и нормальной ткани могут существенно отличаться. Это может быть причиной потенциальной ошибки при идентификации личности: вероятность ошибки от 13,8 до 98%, особенно при карциноме яичников, раке молочной железы и желудочно-кишечного тракта [11, 14—18].

Выраженность несоответствия между кариотипом опухоли и нормальных тканей особенно велика с увеличением степени злокачественности опухоли (достигает до 90,9% случаев при низкодифференцированных серозных карциномах яичников) [19]. В таких ситуациях, помимо изучения SNP-профиля, необходимы дополнительные методы исследования, а также генетическое сравнение ткани, подозрительной в отношении контаминации с другим материалом данного больного [6, 20].

Существует мнение, что тесты для решения вопроса о генетической идентичности нельзя проводить при наличии микросателлитной нестабильности (MSI, наблюдается в 6,7—34% опухолей), так как при этом может существенно измениться структура аллельных вариантов ДНК-полиморфизмов [21]. В связи с этим перед тестом на генетическую идентичность необходимо иммуногистохимическое исследование на наличие MSI в опухоли [21].

В любом опухолевом материале есть определенная доля «нормальной» ткани, которая при отсутствии другого материала может быть использована для решения вопросов о тканевой идентичности [21]. При оценке стромально-контаминированных SNP для идентификации тканей возникают типичные ошибки [22, 23]:

— низкое содержание (менее 30%) и неодинаковые пропорции «нормальных» клеток в опухоли могут приводить к неверным результатам ДНК-типирования. Добиться одинаковой доли опухолевого и нормального компонента в смешанных образцах довольно трудно, а иногда невозможно. В таких ситуациях необходимо провести микродиссекцию опухолевой ткани, но абсолютное и полное разобщение раковых и «нормальных» клеток практически нереально [24];

— стромальные клетки также могут иметь нестабильный геном. Подобное явление доказано для «нормальных» тканей, прилежащих к злокачественным опухолям яичников и молочной железы [25, 26]. В подобных случаях необходимо использовать кровь в качестве контроля, так как в клетках крови локусы сохраняют свою гетерозиготность [26].

Различные ДНК-варианты могут быть в клетках опухоли одного и того же больного (например, при низкодифференцированных серозных карциномах яичников это наблюдается в более 50% случаев) [3, 23, 24, 27, 28]. Внутриопухолевая гетерогенность нередко приводит к существенным различиям между результатами генотипирования замороженных срезов и парафиновых блоков одного пациента [22].

В результате хромосомной перестройки внутри опухоли один и тот же тип геномных вариаций SNP может быть у разных людей вследствие формирования неаллельных гомологичных рекомбинаций (NAHR). Секвенаты разных людей (особенно родственников) при этом высокоидентичны по наличию одинаковых делеций, дупликаций, инверсий и транслокаций ДНК-сегментов [28].

Геном метастатических образований — очень динамическая структура. Установлено, что SNP-профиль метастатических клеток меняется каждый день [29]. Отмечаются несоответствие генома опухолевых клеток при первичном раке яичников и его рецидивах, отличие SNP-профиля рака молочной железы и его метастазов [30, 31].

В связи с этим сомнительно использовать вторичные и рецидивные опухолевые образования для определения идентичности тканей смешанных образцов, особенно при различных сроках возникновения рецидива.

Роль влияния адъювантной или неоадъювантной терапии на хромосомную ДНК опухолевых клеток до сих пор до конца не изучена. Информация об использовании такого материала для идентификации тканей отсутствует [32]. Описан так называемый генотоксический эффект при неоадъювантной терапии [33]. Отмечается, что при назначении химиопрепаратов во многих случаях возникает градиентный феномен в виде однонаправленного изменения экспрессии ключевых генов, ответственных за развитие опухоли [33].

Данные факты могут затруднить интерпретацию результатов тканевой идентификации при идентичных SNP в различных образцах, особенно в условиях родственных связей.

Существует точка зрения, что ткани, фиксированные в формалине и залитые в парафин, лучше не использовать для идентификации личности вследствие высокой вероятности деградации и биохимических изменений опухолевой ДНК [3, 34—36]. Причиной этого могут быть неадекватные условия хранения парафиновых блоков. Через 3 года хранения биохимические изменения ДНК наблюдаются почти в 30% парафиновых блоков [35]. Отсутствие стандартизации свидетельствует о недопустимости сравнения материала, который вырезали в различных медицинских учреждениях и хранили в разных архивных помещениях.

Игнорирование подобных условий становится причиной многочисленных ошибок при молекулярно-генетических исследованиях [35]. В связи с этим существует установка, что парафиновые блоки при сроке хранения более 5 лет использовать для установления генетической идентичности тканей следует с очень большой осторожностью [34]. Другие авторы [37] считают, что парафиновые блоки, хранящиеся в архиве более 7 лет, нельзя применять для SNP-анализа.

У родственников, особенно при близкой степени родства, вероятность случайного совпадения аллелей очень высока [38]. В таких случаях иногда очень трудно определить, принадлежит исследуемый образец одному или нескольким людям, особенно если невозможно сравнить ДНК образца с ДНК предполагаемого родственника, неизвестен вид и степень родства [39, 40].

Нерешенной проблемой остается тканевая идентификация образцов у людей из небольшой ограниченной популяции или народности — популяционных изолятов [39]. Особенно много таких изолятов в горной местности, для которых характерны внутрипопуляционные и родственные браки. Например, среди народов Дагестана частота близкородственных браков составляет от 31,6 до 47,3% (для сравнения в Калифорнии 0,11—2,11%) [39].

На территории Российской Федерации важно учитывать следующие особенности: большое количество онкологических больных из популяционных изолятов. Люди из горных областей, где уровень медицины недостаточно высок, приезжают лечиться в крупные столичные клиники [39]; наличие в одной больнице большого количества онкологических больных с близкородственными связями, вследствие чего в гистологическом архиве могут оказаться парафиновые блоки близких родственников (мамы, бабушки, сестры). При секвенировании такого материала с учетом генетической нестабильности хромосомной ДНК опухоли может быть совпадение большого количества однонуклеотидных полиморфизмов или коротких тандемных повторов [28].

На основе анализа данных литературы для определения генетической идентичности материала предлагаются судебно-медицинские критерии и алгоритм оценки пригодности тканей со злокачественными опухолями, залитыми в парафиновые блоки:

— для исследования не рекомендуется использовать карциномы желудочно-кишечного тракта, молочной железы, а также низкодифференцированные опухоли яичников;

— в сравниваемых образцах не должно быть рецидивных или метастатических образований;

— необходимо исключить из материала исследования ткани, которые подвергались замораживанию при срочном гистологическом исследовании;

— не исследовать парафиновые блоки со сроком хранения более 5—7 лет, а также парафиновые блоки, хранившиеся в неадекватных условиях;

— не сравнивать парафиновые блоки, изготовленные в различных лечебных учреждениях;

— исключить образцы тканей в случаях проведения лучевой терапии или химиотерапии;

— не использовать для исследования опухоли с наличием микросателлитной нестабильности;

— удалить из парафинового блока участки «нормальной» ткани, прилежащие к злокачественному образованию;

— определить перед исследованием возможность наличия родственных связей или взятие образцов от пациентов из популяционных изолятов;

— в сомнительных случаях необходимо сравнивать генотип опухоли с ДНК крови пациентов (за исключением случаев с лейкозом и лимфопролиферативными заболеваниями).

Конфликт интересов отсутствует.