Изучение особенностей распределения карбофурана в организме теплокровных животных

Карбофуран [О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7)-N-метил-карбамат] (син.: фурадан, дайфуран, хинуфур, бетафур, адифур) является системным инсектицидом и нематоцидом, производным карбаминовой кислоты. Применяется как действующее вещество при производстве протравителей семян, а также гранулированных препаратов для борьбы с почвенными вредителями; оказывает антихолинэстеразное действие на организм теплокровных. Чрезвычайно токсичен, LD50 при пероральном введении для крыс составляет 8—14 мг/кг, для собак — 19 мг/кг, для мышей — 44 мг/кг [1—3]. Известны случаи летальных отравлений людей данным соединением в Курской области и Республике Татарстан [4—6].

Широкое применение карбофурана в сельском хозяйстве, его высокая токсичность, описанные в литературе [1, 2, 6] случаи летального отравления вызывают необходимость химико-токсикологического исследования этого соединения.

Цель работы — изучение особенностей распределения карбофурана в организме теплокровных животных.

Объект исследования — карбофуран [О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7)метилкарбамат] фирмы «FMS Corporation» (США) с содержанием основного вещества не менее 99% (определено методом ГЖХ).

Летальное отравление теплокровных животных карбофураном моделировали на лабораторных крысах-самцах. Для этого 25 крысам (5 опытных групп, в каждой по 5 особей с массой тела 235—255 г) вводили в желудок через зонд тройную LD50 отравляющего вещества (42 мг/кг). После гибели животных, которая наступала в течение 1 ч с момента введения карбофурана, трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных в каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них отравляющего агента.

Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, состоящей из 5 особей.

Исследования биологического материала, взятого от отравленных карбофураном и контрольных животных, проводили, используя ранее предложенные нами методики [5, 6].

Изолирование из тканей трупных органов и биожидкостей. Для изолирования использовали смесь растворителей ацетон—этилацетат в соотношении 1:1 по объему. Определенное количество мелкоизмельченного биологического органа или биожидкости заливали двукратным по массе количеством смеси растворителей. При массе биологического материала 2 г или менее масса изолирующего агента составляла 4 г. Смесь выдерживали при периодическом перемешивании в течение 30 мин. Изолирующий агент сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли.

Очистка извлечений методом колоночной хроматографии и количественное определение. Остаток, полученный после испарения растворителя из объединенного извлечения, растворяли в 1,0—1,5 мл смеси растворителей гексан—ацетон (8:2). Полученный раствор вносили в колонку (стеклянная бюретка размером 490×11 мм), заполненную 10 г силикагеля КСС № 3 80/120 мкм; элюент — смесь растворителей гексан—ацетон (8:2). Фракции по 2 мл элюата собирали в отдельные пробирки. По 10 мкл каждой фракции наносили на хроматографическую пластину типа Сорбфил UV-254 и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля в стеклянных камерах с внутренним объемом приблизительно 600 см³, используя подвижную фазу гексан—ацетон (6:4). По наличию пятен на хроматограмме, величина Rf которых соответствовала таковой стандарта, определяли присутствие исследуемого вещества в той или иной фракции. Фракции элюата, содержащие карбофуран (с 7-й по 13-ю), объединяли, испаряли в выпарительной чашке в токе воздуха до полного удаления растворителя. Сухой остаток растворяли в 10 мл хлороформа. По 0,3—2,5 мл полученного раствора вносили в две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме хлороформа и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил UV-254 в виде полосы. На линию старта также наносили раствор вещества-свидетеля (0,02% раствор в хлороформе). Хроматографировали, используя элюент гексан—ацетон (6:4). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Карбофуран идентифицировали по величине Rf.

В дальнейшем анализируемое вещество извлекали (элюировали) из сорбента этанолом, идентифицировали по УФ-спектрам и определяли его количество по интенсивности поглощения в области длинноволнового максимума (278 нм).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятно анализируемого вещества вырезали из хроматограммы, вносили в пробирку и элюировали вещество 10 мл этанола путем периодического перемешивания содержимого пробирки в течение 10 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение на приборе СФ-56 в интервале длин волн 190—340 нм. В случае присутствия больших концентраций анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли этанолом. В качестве стандартного раствора применяли этанольный раствор извлечения, полученный в контрольном опыте. Количество карбофурана в исследуемом биологическом органе или биологической жидкости определяли по уравнению градуировочного графика.

Идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашке № 2 растворяли в 12,5 мл ацетонитрила, вносили раствор в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем содержимого колбы до метки водой. Затем 8 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Объем раствора и объем пробы, вводимые в хроматограф, в случае необходимости могли быть изменены. При хроматографировании использовали жидкостный хроматограф Waters Alliance 2695 (США) с диодно-матричным детектором модели 2996, хроматографическую колонку размером 3,9×150 мм, заполненную обращеннофазным сорбентом Nova Pack С-18 и подвижную фазу ацетонитрил—вода (5:5), подаваемую со скоростью 1 мл/мин. Аналитической являлась длина волны 278 нм. Температура колонки составляла 20 ^оС. Исследуемое вещество идентифицировали по характерному значению времени удерживания, совпадающему с таковым стандарта.

На пластинах ТСХ анализируемое вещество проявлялось на хроматограммах в УФ-свете в виде темно-бордовых пятен на светлом фоне пластины. Величина Rf карбофурана (0,64±0,03) соответствовала величине Rf вещества-стандарта.

Для идентификации карбофурана с помощью УФ-спектрофотометрии сравнивали спектры поглощения этанольных растворов вещества в извлечениях из биологического материала, очищенных по указанной форме, со спектрами поглощения этанольных растворов стандартного вещества. Спектральные кривые, характеризующие поглощение раствора стандарта карбофурана и этого же вещества, выделенного из ряда биологических объектов (органы крыс), совпадали по форме спектральных кривых и положению точек экстремумов (рис. 1). Все спектры поглощения имеют длинноволновую полосу с максимумом 278 нм.

Фоновое поглощение извлечений из тканей внутренних органов и биожидкостей крыс, не получавших карбофурана, по площади и положению относительно линии старта, соответствующих карбофурану, из участков хроматограмм, измеренное при длине волны 278 нм, не превышало 0,027 ед. опт. плотности для извлечений из органов и 0,019 ед. опт. плотности из крови. Анализируемое вещество отсутствовало в паренхиматозных и полых органах, а также в крови животных контрольной серии.

При идентификации методом ВЭЖХ время удерживания карбофурана совпадало со временем удерживания вещества-стандарта и составляло 2,24 мин. На хроматограммах, полученных по результатам хроматографирования анализируемых веществ, не обнаруживали (по сравнению с хроматограммами веществ-стандартов) дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии (рис. 2).

Уравнение градуировочного графика для количественного фотометрического определения карбофурана по поглощению в УФ-области спектра в данном случае имело вид:

А=0,01496∙С – 0,00519,

где, А — оптическая плотность, С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл).

Относительная ошибка среднего результата при определении карбофурана с помощью УФ-спектрофотометрии не превышала 0,87% (n=6; p=0,95).

Результаты определения рассматриваемого соединения в органах и крови отравленных животных представлены в таблице.

Как свидетельствуют полученные данные, карбофуран присутствует в неизмененном виде как в органах (полых и паренхиматозных), так и в биологических жидкостях погибших теплокровных животных. Большое количество соединения обнаружили в желудке с содержимым, тонкой и толстой кишке, яичках с мочевым пузырем и мочеточниками, а также в сердце. В остальных исследованных органах карбофуран присутствовал в меньших количествах и распределялся достаточно равномерно.

1. Изучено распределение карбаминатного пестицида карбофурана в организме теплокровных животных (крысы) при однократном введении в желудок тройной LD50 отравляющего вещества.

2. Установлено присутствие рассматриваемого соединения в неизменном виде в органах и биологических жидкостях погибших животных.

3. Наибольшие количества карбофурана обнаружены в желудке, тонкой и толстой кишке, яичках с мочевым пузырем и мочеточниками, сердце.