Определение амитриптилина и его метаболита нортриптилина в биообъектах трупа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Амитриптилин — 3-(10,11-дигидро-5Н-дибензо-[a, d]-циклогептен-5-илиден)-N, N-диметил-1-пропанамин (см. рисунок) — трициклический антидепрессант, применяемый при депрессиях и тревожных состояниях. Трициклические антидепрессанты занимают одно из ведущих мест по количеству отравлений у взрослых и детей, в том числе со смертельным исходом [1, 2].

Субстанция амитриптилина на российском фармацевтическом рынке представлена в виде различных лекарственных форм (более 20) для перорального, внутримышечного и внутривенного введения. Нортриптилин — 3-(10,11-дигидро-5Н-дибензо[a, d]циклогептен-5-илиден)-N-метил-1-пропанамин (см. рисунок) — основной физиологически активный метаболит амитриптилина. В качестве лекарственного средства нортриптилин в РФ не зарегистрирован, но за рубежом представлен в качестве самостоятельного лекарственного препарата (например, нортриптилин драже, «LACHEMA», Чехия).

Терапевтическая доза амитриптилина [3] при депрессивных состояниях определяется степенью тяжести депрессии, предыдущим опытом лечения и индивидуальной переносимостью препарата, поэтому варьирует в широком диапазоне значений (табл. 1).

Амитриптилин быстро абсорбируется в кровь из желудочно-кишечного тракта и достигает максимальной концентрации в плазме крови через 2—6 ч после приема пероральных лекарственных форм. Вследствие липофильности (объем распределения 20 л/кг) амитриптилин депонируется в жировых тканях, значительная часть препарата (85—98%) связывается белками плазмы крови. Клиническая картина передозировки амитриптилина проявляется уже при приеме 250 мг. Прием 1000—1500 мг вызывает развитие смертельно опасного отравления [4]. Амитриптилин назначают пациентам с неустойчивой психикой, поэтому нередко наблюдаются случаи отравления как при суициде, так и при случайной передозировке [5, 6].

Нортриптилин проявляет физиологическую активность на уровне амитриптилина. В связи с этим терапевтические и токсические концентрации в крови приводятся в виде значений их суммарного содержания [3, 4, 7]. Метод анализа биологического материала должен предусматривать определение как амитриптилина, так и его основного метаболита — нортриптилина [3, 8, 9].

Согласно обзору отечественных и зарубежных публикаций [3, 9—15], существуют методики обнаружения амитриптилина в биоматериалах с использованием ТСХ, ГХ-МС, ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-ДМД. Диапазон предельных минимальных концентраций амитриптилина для указанных методов составляет 0,05—10,0 мг/л.

В сочетании со специфической методикой пробоподготовки ВЭЖХ представляет собой наиболее селективный и чувствительный метод для определения содержания амитриптилина и нортриптилина в биообъектах.

Цель исследования — разработка и валидация методики идентификации и количественного определения амитриптилина и его метаболита нортриптилина в биологических материалах (кровь, моча, ткани печени) методом ВЭЖХ.

Использовали жидкостной хроматограф Agilent 1200 («Agilent Technologies», США) с диодно-матричным детектором (колонка стальная размером 4,6×150 с обращенно-фазовым сорбентом Zorbax Eclipse XDB-C18 (с размером частиц 5 мкм); персональный вортекс V-1 plus («Biosan», Латвия), центрифугу Eppendorf 5810 («Эппендорф», Германия); стандартные образцы налтрексона (N3136−100MG), амитриптилина (A 8404−25G), нортриптилина (N1280000−1EA) производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США).

Биоматериал поступал в отделение общих химических методов исследования бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения Москвы в период с 01.01.12 по 31.04.13.

Все химические реактивы имели марку «хч», а органические растворители — «для хроматографии».

Детектирование проводили при длине волны от 210 до 600 нм. Опорная длина волны для расчета концентрации амитриптилина/нортриптилина — 210 нм. Подвижная фаза: раствор, А — 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, раствор В — ацетонитрил. Скорость хроматографирования 0,7 мл/мин; градиентный режим изменения содержания ацетонитрила: начальную концентрацию 5% ацетонитрила выдерживали в течение 2 мин, далее концентрацию увеличивали до 60% в течение 20 мин.

Калибраторы для анализа готовили из растворов стандартов, которые разбавляли для достижения содержания амитритилина в пробе 3,0, 1,5, 0,15, 0,015 и 0,0075 мкг.

Пробоподготовка биоматериала (кровь или моча): во флакон помещали 3 мл биологической жидкости и выбранное количество амитриптилина, смесь оставляли на 24 ч. Затем добавляли 200 мкл раствора налтрексона (внутренний стандарт) с концентрацией 0,15 мг/мл, перемешивали и оставляли на 15 мин. Далее добавляли 3 мл насыщенного раствора натрия тетрабората и проводили двукратную экстракцию 3 мл смеси гептан-этилацетат-изопропанол (5:5:1). Полученные извлечения центрифугировали, фильтровали через безводный натрия сульфат и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 200 мкл 0,5% раствора трифторуксусной кислоты в 10% растворе ацетонитрила. Затем добавляли 100 мкл гептана, встряхивали 1 мин и центрифугировали. Водную фазу исследовали на жидкостном хроматографе.

Ткани печени: 2 г средней пробы из 30 г измельченной биоткани помещали во флакон, добавляли рассчитанное количество токсиканта и оставляли на 24 ч. Через 24 ч добавляли 200 мкл 0,15 мг/мл раствора налтрексона, перемешивали, настаивали в течение 15 мин. Далее добавляли 4 мл свежеприготовленной смеси ацетонитрил — 18% HCl (9:1), настаивали при постоянном перемешивании в течение 1 ч на механической мешалке, центрифугировали, извлечение декантировали в другой флакон, содержащий 4 мл 2,5% раствора Na2SO4. К извлечению добавляли 3 мл гептана, встряхивали, центрифугировали. Гептановый слой отделяли, водную фазу подщелачивали 2 мл 25% раствора NH3 (рН 10,0 по универсальному индикатору) и проводили трехкратную экстракцию 3 мл эфира, центрифугировали.

Полноту экстракции оценивали, сравнивая значения концентраций токсикантов, вводимых в модельные системы, с концентрациями, полученными в ходе измерений. Потери амитриптилина при изолировании составили от 20 до 50% (εср = 11%), потери нортриптилина — от 32 до 60% (εср =15%).

Идентификацию амитриптилина и нортриптилина проводили по абсолютному времени удерживания, а также путем сравнения УФ-спектров с библиотечными спектрами. Время удерживания для амитриптилина 17,3 мин; нортриптилина 16,9 мин; налтрексона (внутренний стандарт) 9,9 мин. УФ-спектры определяемых соединений идентичны и имеют полосу поглощения с λmax =240 нм.

Установили диапазон концентрации, в пределах которого наблюдалась линейная зависимость между сигналом прибора (отношение площади хроматографического пика определяемого соединения к площади пика внутреннего стандарта) и содержанием амитриптилина или нортриптилина в пробе соответственно 0,09—15,00 и 0,06—10,00 мкг/мл.

Значения коэффициентов корреляции для прямых (y =7642,5x + 15, 329 и y =7945,4x + 54,802) в выбранных диапазонах концентраций обоих соединений (r² =0,99 и r² =1,00) свидетельствуют о надежности выбранной модели.

Предел количественного определения устанавливали по наименьшей концентрации соединений в пробе, определение которой характеризовалось приемлемым уровнем правильности и прецизионности [16]. Так, например, при концентрации амитриптилина в крови 0,045 мкг/мл значения прецизионности и правильности были равны 51,3 и 34,6% соответственно. Это превышало пороговое значение 20% [16]. За предел количественного определения была принята концентрация амитриптилина 0,09 мкг/мл, поскольку валидационные характеристики отвечали требованиям международных стандартов. Например, правильность при количественном определении амитриптилина составила для крови — 11,4%, для мочи — 13,1%, для ткани печени — 8,8%.

Для нортриптилина минимальная концентрация с приемлемым уровнем правильности количественного анализа крови и тканей печени (соответственно 2,9 и 0,3%) равна 0,06 мкг/мл.

Найденные значения пределов обнаружения амитриптилина и нортриптилина приведены в табл. 2.

При валидации метода количественного определения амитриптилина и нортриптилина оценивали возможность разбавления образца. Такая необходимость возникала при недостаточном количестве биоматериала или при содержании ксенобиотика, превышающем диапазон градуировочной зависимости. В этом случае для разбавленного образца вновь проводили определение правильности и прецизионности.

Для проведения данного теста выбрали произвольные концентрации растворов исследуемых веществ: для амитриптилина 0,75 мг/мл, для нортриптилина 0,5 мг/мл. Образцы разбавляли трифторуксусной кислотой в соотношениях 1:3 и 1:8 соответственно.

Правильность и прецизионность, найденные для разбавленных образцов, сопоставимы со значениями для образцов без разбавления. Полученные результаты указывают на возможность применения процедуры разбавления при определении содержания амитриптилина и нортриптилина.

Результаты, полученные на модельных системах, позволили перейти к анализу биоматериалов, поступивших для исследования. С использованием разработанной методики амитриптилин и нортриптилин были обнаружены в 75 образцах (табл. 3).

В 90% проб концентрация определяемых веществ находилась в диапазоне от 0,09 до 40 мкг/мл. Соотношение концентрации амитриптилина и нортриптилина колеблется в следующих интервалах: для печени — 0,26—24, для крови — 0,37—57, для мочи — 0,61—8.

Широкий диапазон соотношений свидетельствует о различном временном интервале между принятием препарата и моментом смерти, а также указывает на фармакогенетичекие особенности погибших, вследствие чего превращение амитриптилина в нортриптилин протекает с разной скоростью.

Таким образом, предлагаемая методика позволяет анализировать биологические материалы с пределом количественного определения амитриптилина 0,09 мкг/мл, а его активного метаболита нортриптилина —0,06 мкг/мл.