Особенности молекулярно-генетической диагностики веррукозной лейкоплакии

Веррукозная лейкоплакия (ВЛ) — заболевание слизистой оболочки рта (СОР), которое считается факультативным предраком. Этиология формирования ВЛ точно не установлена, клинически она проявляется на различных участках СОР и характеризуется разной степенью ороговения. ВЛ встречается в 20% случаев всех форм лейкоплакии, в 3,5% подвергается малигнизации. Существуют различные варианты классификации ВЛ по локализации, выраженности изменения СОР и количеству пораженных участков. При гистологическом исследовании ВЛ выделяют понятия веррукозная гиперплазия (ВГ) и веррукозная карцинома (ВК). ВГ — термин, который используют при описании гиперпластических процессов без признаков атипии, а при ВК — с признаками атипии [1]. Известно, что трансформация ВК в плоскоклеточный рак (ПР) происходит в 7—12% случаев [2]. Учитывая тот факт, что гистологическая диагностика этих нозологий вызывает затруднения, существует потребность разрабатывать дополнительные критерии для их верификации.

История изучения канцерогенеза насчитывает не одно столетие, сегодня предполагают, что канцерогенез — это многофакторный и многостадийный процесс, включающий в себя цепь генетических и эпигенетических повреждений клетки, которые в итоге приводят к выключению механизмов ответа клетки на нормальные ростовые ограничения [3].

В современной диагностике ВЛ часто используют иммуногистохимическое исследование (ИГХ), которое существенно дополняет рутинные гистологические методики для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных процессов. Одним из признаков малигнизации является повышенная пролиферация клеток? для оценки которой применяется универсальный маркер — антитела к белку Ki-67, который выявляется во всех фазах митотического цикла, кроме G₀ [4].

ИГХ позволяет изучать механизмы, лежащие в основе клеточной пролиферации, например активность фермента теломеразы. Данный фермент может быть активен в самом начале развития злокачественных опухолей и в то же время может проявляться при предраковых состояниях.

В молекулярной генетике большое внимание уделяется клеточному циклу, который регулируют теломеры. Теломеры — это специальные структуры на концах хромосом, от которых зависит пролиферирующий потенциал клетки. Теломераза является обратной транскриптазой (TERT Telomerase reverse transcriptase) — фермент, катализирующий синтез ДНК, на матрице РНК [5].

В настоящее время широкое применение получил метод флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ hybridization — FISH). Он сочетает в себе преимущества классических цитологических, цитогенетических и молекулярных методов и может проводиться на тканевых и клеточных препаратах. С помощью FISH возможно посчитать количество копий гена TERC (Telomerase RNA Component), локализованного на хромосомном участке 3q26.2.

Цель исследования — оценить начальные молекулярно-генетические признаки малигнизации веррукозной лейкоплакии.

В работе был использован клинический материал отделения заболеваний слизистой оболочки рта и архивный материал лаборатории патологической анатомии ФГБУ НМИЦ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России за период с 2018—2019 гг. Были исследованы биоптаты СОР 21 пациента (14 женщин, 7 мужчин), с клиническим диагнозом ВЛ, средний возраст которых составил 56,7 лет.

При гистологическом исследовании у 15 (71,4%) пациентов был поставлен диагноз ВГ, а у 6 (28,5%) пациентов — ВК. Гистологическое и ИГХ исследования биопсийного материала проводили согласно стандартным протоколам. Тканевые антигены выявляли с помощью мышиных моноклональных антител к Ki-67 для определения пролиферативной активности клеток (ММ1, Diagnostic Biosystems). Наличие активной теломеразы исследовали при помощи кроличьего иммуноглобулина (TRT, Abbiotec). Также был использован метод FISH, с применением ДНК-зондов (LSP TERC/CCP3 FISH Probe Kit, CytoTest, USA). Зонд LSP TERC включает в себя всю последовательность гена TERC и примыкающую к нему геномную последовательность. Он показывает активацию гена TERC в хромосоме, так как перекрывает соответствующий этому гену участок в 570 тысяч пар оснований. Зонд CCP3 (Chromosome 3 Counting Probe) получен из альфа-сателлитной ДНК-центромеры, отвечающей за связывание веретена деления и последующего расхождения хромосом. Метод FISH проводили в 10 случаев из 15 для ВЛ и во всех 6 случаях ВК.

Индекс пролиферации по Ki-67 определяли по отношению количества клеток с иммунореактивными ядрами к общему числу клеток. Активность теломеразы при ИГХ исследовании оценивали по наличию реакции в ядрах клеток. Реакция FISH оценивалась при помощи флуоресцентного микроскопа (Axio Imager M2, Carl Zeiss) с фотофиксацией (AxioCam ERc 5s), где положительная реакция LSP TERC проявлялась оранжевым цветом, а CCP3 — зеленым. Амплификацию гена оценивали как положительную при наличии более двух оранжевых сигналов, а появление трех и более зеленых сигналов говорило об увеличении количества хромосом.

Большая часть пролиферирующих клеток при ВГ и ВК локализуется в базальном и парабазальном слоях, поэтому оценка экспрессии белка Ki-67 проводилась в 300 клетках мальпигиевого слоя. Теломеразную активность при ИГХ и FISH исследовали в тех же участках, где изучали пролиферацию клеток под увеличением ×200 (ИГХ) и ×1000 (FISH).

Для количественной оценки результатов проводились морфометрические исследования. Статистический анализ осуществляли при помощи программы SPSS Statistics 23 version в среде Windows 10; для достоверности различий количественных признаков при нормальном распределении оценивали при помощи теста Стьюдента; при этом определяли среднее арифметическое (M±m) и среднеквадратичное отклонения (СД); для сравнения распределения номинальных показателей использовали χ² Пирсона, различия между группами признавались значимыми при p<0,05.

При гистологическом исследовании ВГ отмечали утолщение рогового слоя, гиперплазию шиповатого слоя эпителия, в 5 (33,3%) случаях из 15 наблюдали признаки хронического воспаления и широкие эпителиальные выросты в собственную пластинку СОР. При ВК также выявляли гиперкератоз, широкие эпителиальные выросты с атипией клеток росткового слоя на фоне воспалительного инфильтрата в собственной пластинке СОР. Наличие признака атипии клеток являлось отличительным критерием от ВГ (рис. 1, а, б).

Рис. 1.

а — ВГ, окраска гемотоксилин эозин, ×400; б — ВК, окраска гемотоксилин эозин, ×400; в — ВГ: иммуногистохимическая реакция к белку Ki-67 с фоновым окрашиванием гемотокисином Майера, ×400; г — ВК: иммуногистохимическая реакция к белку Ki-67 с фоновым окрашиванием гемотокисином Майера, ×400; д — ВГ: иммуногистохимическая реакция экспрессия теломеразы TERT с фоновым окрашиванием гемотокисином Майера, ×400;е — ВК: иммуногистохимическая реакция экспрессия теломеразы TERT с фоновым окрашиванием гемотокисином Майера, ×400.

При ИГХ исследовании по белку Ki-67 уровень пролиферативной активности клеток мальпигиевого слоя при ВК был выше, чем при ВГ, что характерно для неопластических изменений эпителия СОР. Известно, что в процессе малигнизации происходит увеличение пролиферативной активности клеток [6] (рис. 1 в, г). По результатам статистического анализа между группами были выявлены достоверные различия по всем показателям у ВК среднее значение выше, чем у ВГ (7,31±0,19 и 10,47±0,22 соответственно; среднеквадратичное отклонение (CD) в группе ВК составило 2,01, у пациентов с ВГ 2,39).

Экспрессия теломеразы TERT установлена в ядрах эпителиальных клеток обеих групп (рис. 1, д, е). Это соответствует проведенному ранее исследованию Д.А. Скворцова, М.П. Рубцовой и соавт. (2009), в котором установлено, что теломераза может проявляться в предраковых состояниях и сохраняться в клетках злокачественных опухолей. Теломераза является активным компонентом поддержания длины теломер, что позволяет опухолевым клеткам делиться бесконечно. Сама по себе теломераза не является онкогеном, так как опухолевые клетки могут иметь альтернативный способ поддержания теломер, основанный на рекомбинации. С TERT связана молекула теломеразной TERC, которая используется в качестве матрицы для удлинения теломер. Так, в эмбриональных клеточных линиях теломераза активна, и длина теломер в них остается постоянной, что позволяет клеткам делиться неограниченно. В стволовых клетках активность теломеразы ниже, что лишь частично компенсирует укорачивание теломер. В соматических здоровых клетках активность теломеразы обычно отсутствует. Известно, что теломераза может проявляться в быстро обновляющихся тканях, например, в эпителии кишечника или матки и в клетках с нарушенным метаболизмом [5].

При изучении амплификации TERC участка РНК в третьей хромосоме методом FISH при ВГ амплификация по данному гену отмечена в 2 случаях из 10. Отсутствие амплификации TERC проявлялось как 1—2 оранжевых сигнала на фоне 2-х зеленых сигналов (рис. 2, а). При ВК амплификация по гену TERC отмечалась во всех случаях (рис. 2, б).

Рис. 2. Амплификация TERC методом FISH, ×1000.

а — ВГ (зеленый цвет зонд — CCP3, оранжевый — TERC); б — ВК (зеленый цвет зонд — CCP3, оранжевый — амплификация по зонду LSP TERC).

По результатам статистического анализа между группами были выявлены достоверные различия χ² Пирсона = 9,600; p<0,007.

Ранее было проведено исследование по обнаружению TERC в РНК третьей хромосомы с использованием FISH при диагностике и прогнозировании интраэпителиальной неоплазии шейки матки. По данным авторов G. Yin, J. Li, T. Zhu и соавт. (2012), наличие положительной реакции является предвестником перерождения клетки в опухолевую, что может служить основным показателем начала малигнизации [7]. Существует также исследование по предраковым состояниям и раку гортани, в котором авторы Yu Liu и соавт. (2012) определяли трансформацию нормального эпителия в предрак, а затем в плоскоклеточный рак. Данный процесс связывали с прогрессирующим накоплением генетических изменений, которые приводят к образованию измененных эпителиальных клеток [8].

Проведенное исследование показало, что амплификация гена TERC характерна для злокачественной трансформации эпителиальных клеток при ВК. При ВГ, как правило, амплификация отсутствовала, что может служить доказательством доброкачественного характера патологии СОР. В двух случаях нашего исследования наблюдалась амплификация гена TERC при ВГ, что, скорее всего, свидетельствует о наличии изменений генетического аппарата, которые не проявляются при гистологическом и ИГХ исследованиях. Таким образом, выявление амплификации этого гена может служить основным критерием для ранней диагностики малигнизации ВЛ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.