Получение популяции эктомезенхимных клеток из пульпы постоянных зубов

Актуальность. Одним из важных вопросов биологии, стоматологии и регенеративной медицины является проблема наличия в пульпе зуба стволовых клеток, потомки которых могут дифференцироваться в одонтобласты. Интерес к этому вопросу поддерживается тем, что за последние годы были проведены многочисленные исследования, в которых авторы утверждают, что им удалось выделить стволовые клетки пульпы зуба. Большинство клеток, которые были описаны до этого как стволовые клетки пульпы зуба, представляли собой гетерогенную популяцию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), источником развития которой является как мезодерма, так и нервный гребень. В отличие от ММСК костного мозга или жировой ткани, одонтобласты не являются истинно мезенхимальными клетками и относятся к клеткам так называемой эктомезенхимы, т. е. к производным мезенхимных клеток, берущих начало из области нервного гребня. По данным литературы, одонтобластам присущ ряд признаков, характерных для эктодермальных клеток, таких как экспрессия эпителиального мембранного антигена (ЭМА) и цитокератина 18 (ЦКР 18). Более того, было обнаружено, что клетки промежуточного слоя, прилежащего к одонтобластам, наряду с эпителиальными маркерами, экспрессируют ряд маркеров стволовых клеток, в частности C-kit — рецептор фактора стволовых клеток.

Цель исследования — получить из пульпы постоянных зубов популяции эктомезенхимных клеток со свойствами стволовых и прогениторных клеток и охарактеризовать их фенотип in vitro.

Материал и методы. В качестве материала исследования использовали пульпу постоянных зубов, удаленных по ортодонтическим показаниям (всего 15 зубов) у пациентов в возрасте 18—29 лет. Удаленные зубы помещали в раствор фосфатно-солевого буфера со смесью антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия)). Затем равномерной механической нагрузкой зубы раскалывали с помощью молоточка и свинцовой пластинки и осторожно стерильным пинцетом извлекали цельную пульпу. В стерильных условиях пульпу измельчали и переносили в шестилуночный планшет. Культивирование клеток было проведено в питательной среде аМЕМ («ПанЭко», Россия) с 10% содержанием сыворотки плодов коровы (FBS, «ПанЭко», Россия). Каждые 2 дня проводили замену питательной среды. Всего было выполнено 5 пассажей. Фенотип полученных клеток исследовали на 3-й день каждого пассажа методом иммуноцитохимического окрашивания. Окрашивание антителами к ЭМА, C-kit, и ЦКР 19 проводили во всех пассажах, антителами к эпителиальному специфическому антигену (ЭСА), α-гладкомышечному актину (αГМА), десмину, виментину, ядерному антигену пролиферирующих клеток (ЯАПК) и Bcl-2 — в 3-м и 5-м пассажах. Подтверждение экспрессии ЭМА и ЦКР 18 было выполнено методом иммуноблоттинга.

Результаты. На 3-и сутки наблюдалась миграция клеток из культивируемых кусочков пульпы зуба на периферию. Вся периферия вокруг эксплантата на 12-й день была занята клетками веретенообразной формы. При проведении иммуноцитохимического окрашивания наблюдали в клетках экспрессию C-kit и виментина на всех сроках культивирования. Примерно половина клеток иммуноцитохимически окрашивалась антителами к ЭМА на всех пассажах. Клетки 1-го и 2-го пассажа характеризовались стойкой экспрессией ЦКР 18, однако количество окрашенных клеток с каждым последующим пассажем уменьшалось, и к 5-му пассажу окрашивались лишь единичные клетки. Клетки ранних пассажей не экспрессировали ЦКР 19. Начиная с 3-го пассажа, обнаруживались единичные ЦКР 19 позитивные клетки, тогда как все клетки 5-го пассажа экспрессировали ЦКР 19. Окрашивание клеток против ЯАПК на 3-м и 5-м пассажах происходило лишь в единичных клетках. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами против ЭСА, αГМА, десмина и Bcl-2 не выявило клеток, в которых присутствовали бы данные антигены. На всех сроках нашего исследования мы наблюдали стойкое специфическое иммуноцитохимическое окрашивание полученных клеток из пульпы постоянных зубов человека к маркеру мезенхимальных клеток — виментину. Более интересным, на наш взгляд, является то, что часть клеток, высеявшихся из пульпы зуба, на своей поверхности экспрессировали ЭМА, который, безусловно, может рассматриваться как маркер эпителиальных клеток. Дополнительными доказательствами получения в ходе экспериментов из пульпы зуба именно эктомезенхимных клеток является наличие в культивированных клетках белков промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток цитокератинов 18 и 19.

Вывод. Стойкая экспрессия маркера стволовых клеток C-kit во всех пассажах является признаком того, что культивированные нами клетки обладают фенотипом стволовых и прогениторных клеток и, следовательно, обладают пролиферативным потенциалом, могут быть использованы в тканевой инженерии и регенеративной медицине.