Гендерные особенности ангиогенеза у больных с немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря, осложненным сахарным диабетом 2 типа

Рак мочевого пузыря (РМП) остается одной из наиболее важных проблем в онкоурологической практике во всем мире. В структуре онкологической заболеваемости РМП, по разным данным, занимает от 4-го до 7-го места у мужчин и 11-е место у женщин [1, 2]. Заболеваемость РМП, как во всем мире, так и в России, продолжает расти. На сегодняшний день РМП остается важной медицинской и социальной проблемой в связи с высокой смертностью и инвалидизацией трудоспособного населения [3]. Рак мочевого пузыря по степени инвазии подразделяется на мышечно-инвазивный и немышечно-инвазивный типы. Приблизительно 70% случаев РМП во время первичной диагностики являются немышечно-инвазивными (НМИРМП) [4]. Известно, что НМИРМП представляет собой опухоль, ограниченную слизистой оболочкой (Ta — неинвазивный папиллярный рак, Tis — рак in situ, T1 — рак, ограниченный собственной пластинкой слизистой оболочки). При данном подтипе РМП 5-летняя выживаемость пациентов составляет 89—98%, однако наряду с этим нередко развиваются рецидивы (в 40—60% случаев) и прогрессирование (10—30%) со снижением степени дифференцировки опухоли [5, 6].

С ростом онкологической заболеваемости во всем мире наблюдается тенденция к повышению заболеваемости сахарным диабетом 2 типа (СД2). В мире СД болеют 463 млн человек в возрасте 20—79 лет, еще около 232 млн человек не знают, что у них есть это заболевание, поэтому не получают соответствующего лечения и подвергаются высокому риску развития осложнений, связанных с диабетом [7]. На сегодняшний день установлена связь СД2 с повышенным риском развития и прогрессирования рака разных органов, включая толстую и тонкую кишку, яичники, поджелудочную и молочную железы, почки, пищевод, желудок, эндометрий [8—10]. Данные о влиянии СД2 на течение РМП противоречивы.

Одним из важнейших факторов развития опухоли считается ее способность индуцировать и поддерживать ангиогенез. Ангиогенез является ключевым механизмом в развитии и прогрессировании различных солидных злокачественных новообразований. Поэтому процессы, вовлеченные в данный механизм, представляют интерес для лучшего понимания особенностей онкологического заболевания и поиска маркеров для эффективности терапевтического лечения [11]. В этой области растущее внимание уделяется изучению ангиогенных белков — фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и молекул межклеточной адгезии CD31, высокая экспрессия которых коррелирует с плохим прогнозом и низкими показателями выживаемости у онкологических больных [12, 13]. За последние два десятилетия появилось большое количество публикаций, описывающих особенности ангиогенеза при различных злокачественных новообразованиях. Однако работ, связанных с изучением данного процесса при НМИРМП, практически нет.

Таким образом, на сегодняшний день у ученых нет единого мнения о влиянии СД2 на риск возникновения НМИРМП, неизвестны особенности патогенеза РМП, включая и ангиогенез, протекающего на фоне СД2, не установлены гендерные особенности этого процесса, отсутствуют работы по данной теме в нашей стране. Принимая все это во внимание, необходимо продолжить научный поиск.

Цель исследования — изучить особенности экспрессии ангиогенных белков VEGF и CD31, оценить их гендерную специфичность при НМИРМП, развивающемся на фоне СД2, по сравнению с данными показателями при РМП, формирующемся без коморбидной патологии.

В настоящее ретроспективное исследование включены 40 пациентов обоих полов с уротелиальным НМИРМП (Ta, Tis, T1), верифицированным гистологическим методом и подтвержденным инструментальными неинвазивными и малоинвазивными методами: ультразвуковым исследованием почек, мочевого пузыря, предстательной железы, печени, регионарных лимфатических узлов; рентгенографией легких (в целях исключения или подтверждения метастазов); цистоскопией и магнитно-резонансной томографией (для пациентов основной и контрольной групп). Данные пациенты находились на лечении в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (Ростов-на-Дону) с 2017 по 2022 г. включительно. В основную группу (20 человек) входили пациенты с установленным диагнозом НМИРМП, протекающего на фоне СД2. В контрольную группу (20 человек) включены больные НМИРМП без сопутствующей патологии. Таким образом, из-за малого объема выборки исследование считается ограниченным.

Для участия пациенты подписывали информированное добровольное согласие до момента включения. Внутри каждой группы больные разделены по гендерному признаку. Возраст мужчин основной группы составил от 59 до 80 лет (медиана (Me) 66,5), женщин — от 53 до 79 лет (Me 61). Возраст мужчин контрольной группы — от 55 до 72 лет (Me 63), женщин — от 52 до 83 лет (Me 71).

Уровень глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом на диагностическом анализаторе Vitros 5600 («Ortho-Clinical Diagnostis, Inc.», США). Для патоморфологического анализа фрагменты тканей мочевого пузыря фиксировали в 10% нейтральном растворе забуференного формалина в течение 24 ч с дальнейшей гистологической проводкой материала в автоматическом гистопроцессоре ASP6025 («Leica Biosystems Nussloch GmbH», Германия). После заливки в парафин на станции HistoCore Arcadia («Leica Biosystems Nussloch GmbH», Германия) изготавливали гистологические срезы толщиной 3—4 мкм с помощью микротома Accu-Cut SRM™200 («Sakura Finetek Europe B.V.», Нидерланды) с последующим их окрашиванием гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили на срезах парафиновых блоков опухолей с использованием моноклональных мышиных антител к VEGF (VG1, «Diagnostic BioSystems Inc.», США) к CD31 (JC70, «Cell Marque Corporation», США). Для визуализации применяли систему детекции UltraVision Quanto Detection System HRP DAB («Thermo Shandon Limited (subsidiary of Thermo Fisher Scientific)», UK). Для ИГХ исследования использовали протокол, опубликованный ранее в статьях для исследования других показателей (топоизомеразы-2α, E-кадгерина, ki-67, р53, CD31, ММП-2) [14, 15].

Оценка результатов ИГХ реакции проведена с применением светового микроскопа AxioLab.A1 («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия) при увеличении объектива ×200, ×400. Определяли процентное содержание опухолевых клеток, экспрессирующих VEGF, и количество сосудов, в которых выявлены признаки экспрессии CD31.

Статистическая обработка. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Statistica 13,0 («StatSoft Inc.», США). Результаты, полученные в ходе ИГХ исследования, прошли проверку на соответствие нормальному распределению (критерий Шапиро—Уилка). В связи с тем, что первичные данные не подчинены закону нормального распределения, нами сравнивались группы с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни (U-критерий) с определением медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q₁—Q₃). Использовали поправку Холма—Бонферрони для множественных сравнений. Для оценки тесноты взаимосвязей применяли шкалу Чеддока, для корреляционных связей — критерий Спирмена (rs).

При исследовании экспрессии маркера VEGF выявлено, что максимальные значения (10%) в опухолях встречались у пациентов с СД2, в основном у мужчин, тогда как у женщин с данным заболеванием максимум не превышал 5%. Разброс значений у женщин был однородным (от 2 до 5%), у мужчин различия в экспрессии были несколько выше (от 2 до 8%). У больных без СД преобладали более низкие значения экспрессии (не выше 4%) как у мужчин, так и у женщин (табл. 1).

Таблица 1. Уровень экспрессии VEGF в опухолях у пациентов исследуемых групп

Примечание. * — различия показателей у мужчин и женщин основной группы статистически значимы (p<0,05); ** — различия показателей у мужчин основной и контрольной групп статистически значимы (p<0,05). Здесь и в табл. 2: НМИРМП+СД2 — больные с немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря, осложненным сахарным диабетом 2 типа; НМИРМП без СД2 — больные с немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря без сахарного диабета 2-го типа.

Из результатов, представленных в табл. 1, следует, что медианы значений VEGF в опухолях мочевого пузыря у мужчин с СД2 выше, чем у женщин этой группы и больных обоих полов без сопутствующей патологии. Статистически значимое превышение в 2,8 раза уровня экспрессии VEGF в опухоли обнаружено у мужчин с СД2 по сравнению с женщинами этой же группы (p=0,002) и мужчинами без данной патологии (p=0,001). У женщин обеих групп и мужчин и женщин группы без СД2 различий в показателях экспрессии данного маркера не было (p≥0,05). Таким образом, гендерные различия в экспрессии VEGF отмечены только у пациентов с СД2.

При изучении экспрессии CD31 выявлено, что максимальное количество сосудов, окрашенных данным маркером, отмечено в опухолях женщин с наличием СД2. Разброс значений в этой группе был относительно небольшой (от 10 до 15 сосудов), но у 2 (28,6%) пациенток наблюдали до 25 окрашенных сосудов. У мужчин, наоборот, наблюдался размах значений от 5 до 11 сосудов с максимумом не выше 15. В опухолях больных без СД2 количество окрашенных сосудов имело более низкие значения. У мужчин показатели были выше (от 3 до 13), тогда как у женщин — от 2 до 7.

Результаты, приведенные в табл. 2, демонстрируют, что медианы значений количества опухолевых сосудов в группе с СД2 значительно выше и у мужчин, и у женщин по сравнению с больными без сопутствующей патологии. У женщин группы с СД2 отмечено статистически значимое превышение количества сосудов — в 1,3 раза (p=0,042) по сравнению с мужчинами. У женщин этой же группы выявлено превышение количества сосудов в опухоли в 3 раза (p=0,009) по сравнению с женщинами без сопутствующей патологии. Остальные различия не имели статистической значимости (p≥0,05). При анализе полученных результатов установлено, что у женщин с СД2 плотность микрососудов в опухоли превышала плотность сосудов у мужчин с этой же патологией и женщин без СД2.

Таблица 2. Количество сосудов, окрашенных CD31, в опухолях у пациентов исследуемых групп

Примечание. * — различия показателей у мужчин и женщин основной группы статистически значимы (p<0,05); ** — различия показателей у женщин основной и контрольной групп статистически значимы (p<0,05).

Помимо изложенного, после обработки результатов ИГХ исследования нами проведен корреляционный анализ значений экспрессии исследуемых маркеров в опухоли с уровнем глюкозы каждого пациента. Данные представлены на рис. 1, 2.

Рис. 1. Зависимость значений экспрессии маркера VEGF от уровня глюкозы.

а, б — больные раком мочевого пузыря без сахарного диабета 2 типа; в, г — больные с коморбидной патологией.

Рис. 2. Зависимость значений экспрессии маркера CD31 от уровня глюкозы.

а, б — больные раком мочевого пузыря без сахарного диабета 2 типа; в, г — больные с коморбидной патологией.

Сопоставление данных на рис. 1 демонстрирует, что у пациентов обоих полов как с СД2, так и без него теснота взаимосвязи между уровнем глюкозы и экспрессией маркера VEGF по шкале Чеддока слабая.

В отличие от корреляции с маркером VEGF, CD31 демонстрирует высокую тесноту взаимосвязи (см. рис. 2) у пациентов исследуемых групп. Только у женщин группы без СД2 сила связи определена как умеренная.

Таким образом, в результате анализа установлены однонаправленные корреляционные связи в группе с СД2 и разнонаправленные — в группе без сопутствующей патологии. У больных группы с наличием СД2 определена статистически значимая положительная корреляция уровня экспрессии CD31 как у мужчин, так и у женщин (у мужчин коэффициент корреляции Спирмена rs=+0,768, у женщин — rs=+0,829). Корреляционные связи значений экспрессии VEGF с уровнем глюкозы у мужчин в данной группе статистической значимости не имели (rs=+0,145), у женщин наблюдалась тенденция к статистической значимости (rs=+0,518). Из пациентов группы без СД2 найдена статистически значимая положительная корреляционная связь уровня глюкозы с экспрессией CD31 только у мужчин (rs=+0,873). У женщин данная связь отрицательная и без статистической значимости (rs=–0,321). У этих же пациенток отмечена отрицательная корреляция и с уровнем экспрессии VEGF (rs=–0,027). У мужчин данной группы положительная корреляционная связь уровня глюкозы с экспрессией VEGF статистической значимости не имела (rs=+0,070).

Онкологические заболевания и СД2 находятся в ряду наиболее распространенных заболеваний человека, частота которых возрастает год от года. В последнее десятилетие рост выживаемости больных с онкологической патологией, который связан с повышением эффективности лечения, привел к увеличению доли пациентов, живущих с двумя сопутствующими хроническими заболеваниями и более. Одним из часто встречающихся таких заболеваний является СД2 [16]. На сегодняшний день установлена связь СД2 с повышенным риском развития и прогрессирования рака многих локализаций, однако по поводу РМП у ученых нет единого мнения. В многочисленных исследованиях проведена оценка связи СД2 с риском развития НМИРМП, однако получены противоречивые результаты. Так, например, ряд исследователей считают, что СД2 связан с риском развития РМП как у мужчин, так и у женщин [17], другие — отмечают, что для женщин такая связь не характерна [18], третьи — наоборот, нашли связь только в отношении женщин [19], четвертые — утверждают, что нет подобной связи ни у мужчин, ни у женщин [20—22]. В нашей стране исследования, посвященные поиску связи СД2 и НМИРМП, в последнее время не проводились.

Влияние СД2 на течение злокачественного процесса и наличие гендерной специфики такого влияния давно изучаются в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (Ростов-на-Дону). Наша работа явилась продолжением исследований, проводимых в данном учреждении. Нами рассмотрены гендерные особенности ангиогенеза РМП, протекающего на фоне СД2, по сравнению с НМИРМП без сопутствующей патологии. Оценивали их с помощью маркеров VEGF и CD31 (плотность микрососудов). Установлено, что экспрессия VEGF была статистически значимо повышена (p=0,002) только у мужчин с СД2, тогда как у женщин с СД2 и пациентов обоих полов без сопутствующей коморбидной патологии уровень экспрессии был низким. Взаимосвязь экспрессии данного маркера в опухоли с уровнем глюкозы у всех пациентов исследуемых групп не имела статистической значимости (p≥0,05). Плотность микрососудов в опухоли, окрашенных маркером CD31, была статистически значимо выше у пациентов обоих полов с СД, но у женщин показатели были выше, чем у мужчин. Это также подтверждалось наличием высокой взаимосвязи между экспрессией CD31 и уровнем глюкозы у пациентов обоих полов с сопутствующей коморбидной патологией.

Ангиогенная активность маркеров VEGF и CD31 преобладала в опухолях у мужчин с сахарным диабетом 2 типа, тогда как у женщин с сопутствующей патологией отмечена только активность CD31. Несмотря на полученные результаты, нельзя сделать однозначный вывод о влиянии сахарного диабета 2 типа на развитие немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря только у мужчин. Скорее всего сахарный диабет 2 типа влияет на развитие рака мочевого пузыря как у мужчин, так и у женщин, но из-за ограниченности выборки подтвердить данный факт не удалось. Для окончательных выводов необходимо продолжить исследования с большим числом пациентов и расширенной панелью ангиогенных маркеров.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Атаева Е.М., Ульянова Е.П.; сбор и обработка материала — Шульгина О.Г., Черникова Е.Н., Швырёв Д.А., Хван В.К., Фаенсон А.В.; статистическая обработка данных — Ульянова Е.П.; написание текста — Атаева Е.М., Ульянова Е.П.; научное редактирование — Сагакянц А.Б., Каплиева И.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution: concept and design of the study — Ataeva E.M., Ulyanova E.P.; material collection and processing — Shulgina O.G., Chernikova E.N., Shvyrev D.A., Hwang V.K., Faenson A.V.; statistical data processing — Ulyanova E.P.; writing of the text — Ataeva E.M., Ulyanova E.P.; scientific editing — Sagakyants A.B., Kaplieva I.V.