К вопросу о валидации метода определения соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2V617F), кальретикулина (CALR) и рецептора тромбопоэтина (MPL) в образцах сухих капель крови

Выявление соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2), кальретикулина (CALR) и рецептора тромбопоэтина (MPL) в пробах венозной крови включено в клинические рекомендации ВОЗ в качестве одного из основных диагностических критериев хронических Ph-негативных миелопролиферативных неоплазий (ХМН) [1]. Однако высокая стоимость проведения редких молекулярно-генетических тестов в клинико-диагностических лабораториях, обслуживающих малонаселенные регионы, ограничивает доступность тестирования и своевременность диагностики данных онкогематологических заболеваний. Хранение и транспортировка пробирок с венозной кровью сопряжены с определенными трудностями обеспечения безопасности и преаналитической надежности проб. Ранее в нашей лаборатории была показана возможность выявления мутации V617 °F JAK2 в материале, полученном неинвазивным путем (при использовании жевательных композиций) [2], однако эта альтернативная технология, в отличие от тестирования цельной крови, не позволяет гарантировать точность количественного определения нагрузки мутантного аллеля.

В последние годы во всем мире получила широкое распространение технология отбора, транспортировки, хранения и анализа проб биологических жидкостей в виде сухих пятен — DBS (от англ. dried blood spot, или сухих капель крови — СКК) [3]. При использовании технологии СКК несколько капель образца наносят на небольшой лист подготовленной целлюлозной бумаги и высушивают на воздухе. В таком виде образец биоматериала можно хранить в течение продолжительного времени с сохранением функциональных свойств содержащихся в нем компонентов. После транспортировки в лабораторию вырезают из сухого образца части в виде диска определенного размера, экстрагируют и проводят выявление исследуемых веществ стандартными аналитическими методами. К преимуществам технологии СКК следует отнести простоту и доступность использования для отбора и хранения образцов, существенное сокращение расходов на хранение и транспортировку, возможность использования в скрининге. Вместе с тем в Российской Федерации до сих пор не были валидированы методы выявления драйверных мутаций хронических миелоидных опухолей из образцов СКК.

Целью настоящей работы явилось сопоставление результатов выявления диагностически важных мутаций в генах JAK2, CALR и MPL при использовании стандартного тестирования проб венозной крови и образцов из СКК.

В настоящем исследовании использовали свежесобранные пробы крови 105 пациентов, поступившие для проведения молекулярно-генетических исследований при подозрении на ХМН, а также пациентов с установленным диагнозом с целью мониторинга за трансформированным клоном клеток. Образцы крови поступали в вакутейнерах с ЭДТА. В лаборатории готовили образцы СКК, помещая небольшой объем крови на карточки из ватмана [4] и подвергая последующему высушиванию на воздухе в течение 20—30 мин. Карточки в дальнейшем помещали в индивидуальные конверты и хранили при комнатной температуре в течение 1—8 дней до проведения тестирования.

Вырезанные из карточки образцы с пятном сухой крови помещали в пробирку, экстракцию проводили 500 мкл лизирующего раствора, входящего в состав набора ДНК-Сорб-В (ООО «Интерлабсервис», Россия) в течение 1 ч при 65 °C.

Выделение ДНК из экстракта и образцов свежей крови осуществляли с использованием набора ДНК-Сорб-В (ООО «Интерлабсервис», Россия).

С целью выявления мутации V617 °F JAK2 использовали разработанный нами набор реактивов для метода аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [5]. Мутации в гене кальретикулина CALR определяли в соответствии с описанным нами ранее методом [6], мутации в гене рецептора тромбопоэтина — по методике [7].

Для проведения статистической обработки использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0. Для оценки корреляционных связей использовали непараметрический метод Спирмена.

Результаты сравнительного выявления мутации в образцах СКК и цельной крови представлены в таблице. Во всех исследованных пробах пациентов, не имеющих клонального заболевания, мутации исследуемых генов обнаружены не были ни при тестировании цельной крови, ни при тестировании образцов СКК, что говорит о достаточной специфичности анализов с использованием СКК. Одновременно как в цельной крови, так и в образцах СКК совпали все 43 позитивных результата тестирования на мутацию V617 °F JAK2, 8 позитивных результатов на мутации в гене CALR и 1 положительный результат выявления мутации W515K в гене MPL. Таким образом, 100% совпадение всех 105 результатов тестирования двух вариантов образцов позволяет гарантировать отсутствие расхождений с вероятностью более 95% (p<0,05).

На рисунке представлены данные корреляции между результатами количественного определения уровня нагрузки мутантного аллеля JAK2V617 °F при использовании для тестирования образцов цельной крови и СКК. Высокая значимая корреляция (r=0,96, p<0,05) свидетельствует, что приготовленные из проб крови пациентов СКК можно использовать также и для мониторинга циркулирующего трансформированного клона клеток при ХМН.

Таким образом, в настоящем исследовании продемонстрировано полное совпадение результатов тестирования цельной крови и образцов СКК на основные диагностически важные мутации в генах JAK2, CALR и MPL. Также показана высокая корреляционная зависимость (r=0,96, p<0,05) количественных результатов тестирования аллельной нагрузки JAK2V617 °F, что позволяет предложить использование технологии СКК как при первичной диагностике, так и для мониторинга эффективности терапии хронических миелопролиферативных неоплазий.

Авторы выражают признательность врачам-гематологам КГБУЗ «Красноярская краевая клиническая больница» и КГБУЗ «Городская клиническая больница № 7» за предоставленные пробы крови пациентов.

Участие авторов:

Проведение молекулярно-генетических исследований, правка текста статьи, анализ результатов: А.С.Г.

Написание и правка текста статьи, подборка литературы по теме исследования, выделение ДНК: М.А.С.

Идея исследования, написание текста статьи: И.А.О.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Источники финансирования: бюджетные программы НИР КНЦ СО РАН и СФУ, фонд инноваций общественной организации «МедЛабДиагност».