Распространенность и тип мутаций у пациентов дерматовенерологического профиля московского региона за период 2014—2018 гг.

Mycoplasma genitalium — микроорганизм, относящийся к классу Mollicutes, является самым маленьким прокариотом, способным к самостоятельной репликации. Первое описание М.genitalium датировано 1981 г., однако трудности диагностики на много лет остановили изучение данного возбудителя [1]. М.genitalium признана инфекцией, передаваемой половым путем (ИППП), вызывающей острый и хронический негонококковый уретрит (НГУ) у мужчин, цервицит и воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) у женщин [2, 3]. Роль М.genitalium в развитии некоторых других клинических синдромов дискутабельна и является предметом научных исследований [4]. В ранних серологических исследованиях M.genitalium-инфекции получены противоречивые результаты, отчасти из-за отсутствия достаточно чувствительных и специфичных диагностических тестов. Разработка методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) позволила продолжить исследования по изучению М.genitalium на более высоком уровне. Передача M.genitalium при различных формах половых контактов доказана в работах, демонстрирующих соответствие инфекционного статуса М.genitalium у половых партнеров, а также с помощью мультилокусного генотипирования, демонстрирующего идентичность генотипов выявленного микроорганизма у 87% инфицированных половых партнеров [5, 6]. Установлено, что наличие других возбудителей ИППП повышает риск инфицирования М.genitalium. В кенийском исследовании, посвященном работникам секс-бизнеса, было показано, что женщины с инфекциями Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhea более подвержены присоединению M.genitalium-инфекции [7]. В лондонском когортном исследовании студенток в составе более 2000 участниц [8] также показано, что бактериальный вагиноз и наличие более двух половых партнеров в течение 12 месяцев увеличивают риск инфицирования M.genitalium наряду с другими ИППП [8]. Еще одно африканское исследование продемонстрировало связь ВИЧ-инфекции с повышенным риском заболеваемости M.genitalium в 2,17 раза, что согласуется с рядом других научных работ [7,9—12].

Обнаружение М.genitalium является безусловным показанием для назначения этиотропной терапии. Лечение больных M.genitalium-инфекцией предотвращает дальнейшую передачу возбудителя и развитие осложнений [13]. Для терапии заболеваний, ассоциированных с М.genitalium, традиционно использовались тетрациклины, макролиды и фторхинолоны, однако в связи со стремительно развивающейся устойчивостью M.genitalium к антибактериальным препаратам вопрос выбора адекватной тактики ведения больных нуждается в уточнении.

Резистентность к макролидам является актуальной проблемой, и в настоящее время показатели устойчивости в мире оцениваются в 30—100% [14]. Наиболее часто резистентность развивается при мутациях в положении A2058 или A2059 (нумерация Escherichia coli) 23S рРНК, впервые выявленная в Австралии в 2008 г. [15, 16]. Во всем мире сообщается о различных показателях устойчивости. В скандинавском исследовании сообщалось о резистентности M. genitalium к макролидам в 41,1% урогенитальных и экстрагенитальных образцов [15]. В Испании зарегистрирована резистентность к макролидам в 20% M.genitalium-положительных образцов [17]. В Великобритании устойчивость к макролидам была обнаружена в 82,4% образцов [18]. Исследование, проведенное в американской клинике первичной медицинской помощи, показало, что частота выявления M.genitalium в биологическом материале органов мочеполовой системы и прямой кишки составляет 10,8 и 6,4% соответственно, при этом мутации устойчивости к макролидам выявлены в 70,6 и 80% случаев соответственно [19].

В недавно опубликованном метаанализе проведено сравнение результатов лечения пациентов, получавших 1,0 г азитромицина однократно, с пролонгированным 5-дневным курсом (500 мг/сут, затем 250 мг/сут в течение 4 дней). Наблюдение показало, что у 91,5% пациентов, получивших азитромицин в однократной дозе 1,0 г, были обнаружены мутации, определяющие устойчивость к макролидам, по сравнению лишь с 3,7% пациентов, получавших 5-дневный курс лечения. У 100% пациентов с M.genitalium-инфекцией, вызванной мутантными штаммами, лечение 1,0 г азитромицина оказалось неэффективным [20]. Данное наблюдение доказывает, что однократное назначение 1,0 г азитромицина приводит к формированию новых мутаций устойчивости в процессе терапии.

Австралийская клиника заменила эмпирическое лечение первой линии терапии негонококкового уретрита, цервицита и проктита на доксициклин по 100 мг 2 раза в сутки в течение 7 дней. После этого проводился тест на устойчивость к макролидам. Для восприимчивых штаммов применялся пролонгированный курс азитромицина (1,0 г в 1-й день и 500 мг ежедневно в течение 4 дней); для устойчивых к макролидам изолятов назначался ситафлоксацин (100 мг 2 раза в день в течение 7 дней) [21]. Анализ результатов показал излечение у 94,8% больных с чувствительными к макролидам образцами M.genitalium и у 92,2% пациентов с устойчивыми к макролидам штаммами. Установление факта, что доксициклин снижает бактериальную нагрузку в моче, привело к рассмотрению предварительного назначения доксициклина для лечения M.genitalium-инфекции [21]. Данная схема была включена в национальное австралийское руководство по ведению пациентов с M.genitalium-инфекцией, разработанное в 2018 г. [22].

Моксифлоксацин рекомендован в качестве препарата второй линии для лечения M.genitalium-ифекции [1, 14, 22]. Первые сообщения о случаях резистентности к фторхинолонам появились в 2013 г. в Австралии [23].

Мишенями для фторхинолонов являются ДНК-гираза (состоящая из двух субъединиц GyrA и GyrB) и топоизомераза IV (состоящая из двух субъединиц ParC и ParE) [24]. Резистентность связана с изменениями в ферментах топоизомеразы, особенно с аминокислотным замещением в области, определяющей устойчивость к хинолону (QRDR-quinolone-resistance determining region) гена parC, преимущественно в локусах S83 и D87 (нумерация M.genitalium), и с мутациями в gyrA [15, 23, 25]. Однако однонуклеотидный полиморфизм в генах gyrA и parC недостаточно хорошо коррелирует с резистентностью к моксифлоксацину и ситафлоксацину из-за недостаточности данных клинических изолятов [26]. Связь других мутаций в этих генах с антимикробной восприимчивостью и клиническими исходами в настоящее время также неясна.

В Японии моксифлоксацин не одобрен для лечения генитальных инфекций, поэтому в терапии M.genitalium-инфекции используют ситафлоксацин. Первичные исследования показали высокую эффективность ситафлоксацина в отношении M.genitalium-инфекции, включая мутантные штаммы, несущие изменения одной аминокислоты в гене parC M.genitalium [27—29]. В 2016 г. в Японии T. Deguchi и соавт. выявили неудачи лечения у двух мужчин с уретритом, обусловленным M.genitalium, при этом выделенные изоляты имели единичные аминокислотные изменения как в гене GyrA, так и в гене ParC, отвечающие за резистентность к фторхинолонам [30]. Японское исследование 627 образцов мужчин с острым уретритом показало, что только у 20% выделенных изолятов M.genitalium отсутствовали мутации, у 70% имелись единичные аминокислотные замены в ParC, которые снижали эффективность фторхинолонов, но сохраняли чувствительность к ситафлоксацину [25]. У данных изолятов также были обнаружены мутации 23S рРНК, определяющие устойчивостью к макролидам. В проведенном исследовании распространенность M.genitalium с аминокислотными заменами как GyrA, так и ParC и мутациями в гене 23S рРНК составила 15% в 2016 г. и 10% в 2017 г. [25].

В Европе резистентность к фторхинолонам встречается реже; первый устойчивый изолят был выявлен в Лондоне в 2011 г. [31]. Этот штамм не имел мутаций, связанных с резистентностью к макролидам, и был успешно элиминирован с помощью азитромицина [32].

Доксициклин является тетрациклином второго поколения с хорошей биодоступностью благодаря своей липосорастворимости и бактериостатическому эффекту за счет блока синтеза белка рибосом [33]. У M.genitalium не выявлены мутации, связанные с резистентностью к тетрациклинам, в том числе нет доказательств приобретенных tet генов (ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину) [33]. Минимальная ингибирующая концентрация определяет восприимчивость к тетрациклинам, но у многих изолятов M.genitalium обнаруживается снижение чувствительности, механизм которого до настоящего времени неизвестен и подлежит дальнейшему изучению [1, 34].

Результаты лечения M.genitalium-инфекции доксициклином являются переменными. Препарат рекомендуется в качестве препарата третьей линии после неудач лечения азитромицином и моксифлоксацином, но и в этих случаях его эффективность составляет не более 30% [1, 33].

В России было проведено всего одно исследование, посвященное изучению распространенности мутантных изолятов M.genitalium, — в 2013—2016 гг. в трех городах [35]. Согласно полученным данным, доля резистентных штаммов к макролидам и фторхинолонам составила 4,6 и 6,2% соответственно. Изучение распространенности и типа мутаций M.genitalium до настоящего времени в Московском регионе не проводилось.

Цель: оценить частоту и тип мутаций M. genitalium в динамике у пациентов дерматовенерологического профиля Московского региона за период 2014—2018 гг.

В течение 2014—2018 гг. в филиалах Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии ДЗМ (МНПЦДК ДЗМ) были собраны образцы биологического материала 645 больных М.genitalium-инфекцией. Детекция М.genitalium осуществлялась с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР; набор реагентов для выявления ДНК М.genitalium в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Mycoplasma genitalium-FL» по ТУ 9398−042−01897593−2009 № ФСР 2007/00580). Далее изучался тип генетических мутаций штаммов М. genitalium (методика для определения антибиотикорезистентности М.genitalium к макролидам и фторхинолонам с помощью ПЦР в реальном времени с последующим секвенированием). Лабораторные исследования выполнены в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Частота выявления M.genitalium-инфекции среди пациентов МНПЦДК ДЗМ в 2015—2018 гг. составила 1,8—3,7%, что сопоставимо с уровнем распространения гонококковой инфекции за данный период (2,2—3,87%). Согласно международным данным (систематический обзор и метаанализ 2018 г.), из 3316 проверенных записей в случайно отобранных выборках из общей популяции суммарная распространенность M.genitalium-инфекции составила 1,3% в странах с более высоким уровнем развития и 3,9% в странах с более низким уровнем развития [9].

В нашем исследовании были изучены образцы биологического материала 645 пациентов с M.genitalium-инфекцией. Распространенность и характер мутаций M.genitalium представлены в таблице.

Таким образом, при изучении мутаций, ассоциированных с развитием резистентности к макролидам, количество «диких» штаммов составило 597 (92,6% от 645 образцов). Количество мутантных изолятов за весь период наблюдения составило 48 (7,4%).

Установлено, что во всех случаях мутации M.genitalium были связаны с нуклеотидными заменами в V-домене гена 23S рРНК в позициях А2058, А2059 и А2062, которые определяют резистентность к макролидам. Наиболее частыми были мутации в позициях А2058 (18 из 48, или 37,5%) и А2059 (24 из 48, или 50%); реже встречались мутации в позиции А2062 (6 из 48, или 12,5%).

При изучении мутаций, ассоциированных с развитием резистентности к фторхинолонам, количество «диких» штаммов составило 582 (90,2%), количество мутантных штаммов — 63 (9,8%).

Мутации, ассоциированные с резистентностью к фторхинолонам, локализовались в гене ParC M.genitalium и распределялись следующим образом: позиция A247 — 4 образца (6,4% от 63 образцов); позиция G248 — 24 (38,1%); позиция T249 — 1 (1,55%); позиция T250 — 2 (3,2%); позиция G259 — 31 (49,2%); позиция A260 — 1 (1,55%). Ген ParC M. genitalium кодирует фермент ДНК-гиразу. ДНК-гираза относится к семейству ДНК-топоизомераз II и является одним из ключевых ферментов репликации ДНК. Таким образом, наиболее частыми были мутации в позициях G248 (38,1%) и G259 (49,2%); мутации в других позициях встречались значительно реже.

В ходе исследования выявлены штаммы M.genitalium, содержащие одновременно мутации устойчивости к макролидам и фторхинолонам. Количество таких мутантных изолятов за весь период наблюдения составило 13 (2%) из 645. Типы мутаций в мультирезистентных штаммах распределялись следующим образом: позиции A2058G+G259A — 7 (53,9%) образцов из 13; позиции A2059G+G248T — 2 (15,4%); позиции A2059G+G259A — 2 (15,4%); позиции A2058G+G248A — 1 (7,7%); позиции A2059G+A247C — 1 (7,7%). Таким образом, наиболее частыми были мутации в позициях A2058G+G259A (53,9%); мутации в других позициях встречались значительно реже.

Анализ результатов исследования образцов, собранных в течение четырех разных временных периодов, показал, что в первый период сбора образцов ДНК M.genitalium (2014—2015 гг.) мутации, ассоциированные с резистентностью M.genitalium к макролидам, регистрировались в 6,02% образцов; во второй период (2016 г.) — в 6,52% образцов; в третий период (2017 г.) — в 7,89% образцов; в четвертый период (2018 г.) — в 15,69% образцов. То есть в четвертый период наблюдения частота мутантных штаммов M.genitalium к макролидам выросла в 2,6 раза по сравнению с первым.

Мутации, ассоциированные с резистентностью M.genitalium к фторхинолонам, в 2014—2015 гг. регистрировались в 7,14% образцов; в 2016 г. — в 9,42% образцов; в 2017 г. — в 12,63% образцов; в 2018 г. — в 13,73%. Таким образом, в четвертый период наблюдения частота выявления мутантных штаммов M.genitalium выросла в 1,9 раза по сравнению с первым.

1. Распространенность M.genitalium-инфекции в Московском регионе в 2015—2018 гг. составила 1,4—2,3%, что согласуется с общемировыми показателями.

2. Частота выявления мутантных штаммов M.genitalium к макролидам в Московском регионе в 2014—2018 гг. составила 7,4%, к фторхинолонам — 9,8%.

3. Мутации к макролидам чаще всего наблюдались в позициях А2058 (37,5%) и А2059 (50%); к фторхинолонам — в позициях G248 (38,1%) и G259 (49,2%).

4. В 2014—2018 гг. отмечается рост количества мутаций M.genitalium к макролидам — в 2,6 раза и к фторхинолонам — в 1,9 раза.

5. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего мониторинга устойчивости штаммов M.genitalium к антимикробным препаратам и оптимизации схем терапии, обеспечивающих снижение уровня антибиотикорезистентности M.genitalium.

Сведения об авторах

Романова И.В. — https://orcid.org/0000-0001-9702-4655

Кисина В.И. — https://orcid.org/0000-0002-3761-9400

Хайруллина Г.А. — https://orcid.org/0000-0003-1544-0730

Фриго Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-6231-971X

Жукова О.В. — https://orcid.org/000-0001-5723-6573

Гущин А.Е. — https://orcid.org/0000-0002-0399-1167

Автор, ответственный за переписку: Романова И.В. —
e-mail: irina.vm@inbox.ru