Микробиологическое обоснование фотодинамической терапии в комплексном лечении заболеваний пародонта

Фотодинамическая терапия (ФДТ) инфекционных заболеваний, вызванных бактериальными возбудителями, основана на процессах взаимодействия активных форм кислорода (АФК) и токсичных радикалов респираторного метаболизма с протективными и антистрессорными факторами бактерий, исходы которого могут быть различными в зависимости от интенсивности генерации АФК, активности антистрессорных протеинов, антиоксидантных ферментов бактерий и многих других факторов (Орехова Л.Ю., Лобода Е.С., 2013).

В 1980 г. впервые для ФДТ начали использовать лазерное излучение длиной волны 630 нм (Dougherty T.J. и соавт., 1980). Благодаря значительному прогрессу в области фотобиологии, лазерной и оптоволоконной техники метод ФДТ получил широкое распространение во всем мире и начал применяться как антимикробное водействие.

Антимикробная ФДТ с различными фотосенсибилизаторами (гематопорфирин, метиленовый синий, толуидиновый синий и др.) была предложена как минимально инвазивная альтернатива при лечении локализованных инфекций в ответ на проблему растущей резистентности к антибиотикам, в том числе в стоматологической практике. При антибактериальной ФДТ с фотосенсом фотодеструкция, в основном, вызвана повреждением цитоплазматической мембраны и ДНК бактерий, что ведет к гибели значительной части популяции (Bertoloni G. и соавт., 2000; Romanova N.A. и соавт., 2003; Schafer M. и соавт., 1998).

Однако в настоящее время нет четких аргументированных данных, какой из предложенных фотосенсибилизаторов является оптимальным для достижения максимального антибактериального эффекта.

В связи с вышеизложенным, цель исследования — лабораторное обоснование эффективности действия ФДТ с фотосенсибилизатором (ФС) толуидиновый голубой в отношении пародонтопатогенной микрофлоры полости рта в эксперименте in vitro и клинической стоматологической практике у пациентов молодого возраста с воспалительными заболеваниями пародонта.

Материал и методы. У пациентов с хроническим пародонтитом и здоровых детей выделены 7 клинических изолятов представителей пародонтопатогенных бактерий и нормальной микрофлоры полости рта: грамотрицательные анаэробные — актинобацилла Aggregatibacter actinomycetemcomitans, порфиромонас Porphyromonas gingivalis, фузобактерий Fusobacterium nucleatum, дрожжевые грибы рода кандида Candida albicans.

Обследованы 30 пациентов в возрасте от 7 до 16 лет с воспалительными заболеваниями пародонта, в том числе: 12 с хроническим катаральным гингивитом (5 мальчиков и 7 девочек), 18 — с хроническим пародонтитом (8 мальчиков и 10 девочек), которым проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для идентификации представителей пародонтопатогенной микрофлоры.

У всех больных в соответствии с целями и задачами исследования определяли гигиеническое состояние полости рта по Федорову—Володкиной (1971) с использованием ревеляторов на основе эритрозина (динал), папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс — РМА (Масслер М., Шур Д., 1948) в модификации С. Парма (1960); индекса кровоточивости десневой борозды (SBI) по Muhlemann и Son (1971) и сосочков (PBI) по Saxer и Muhlemann, глубину пародонтального кармана с помощью методики зондирования, степень подвижности зубов, пародонтальный индекс (Рассел А., 1956). Рентгенологическое исследование включало ортопантомограммы до начала курса лечения и через 6 мес после его завершения, а также внутриротовые рентгенограммы. Микробиологическое изучение патологического содержимого пародонтальных карманов осуществляли с помощью мультиплексной ПЦП с диагностическим набором МультиДент-5 (Россия). Дальнейшее выделение и детекцию ДНК пародонтопатогенных бактерий осуществляли в соответствии с медицинской технологией ФС-2006/043-У, разработанной на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова. Для определения чувствительности выделенных штаммов применяли собственную модификацию метода серийных разведений, модификацию дискодиффузионного метода Керби—Бауэра. Статистическая обработка результатов проведена с помощью метода вариационной статистики с определением средней величины, ошибки средней величины и вероятности различий р (за достоверную разницу принимали р<0,05).

Результаты. В процессе моделирования фотодинамической реакции со штаммами грамотрицательных анаэробных бактерий пародонтопатогенной группы установлено следующее. При использовании минимальной концентрации ФС (Cmin) достоверных изменений количества бактерий исследуемых штаммов не выявлено. При использовании средней и высокой концентрации ФС отмечено достоверное снижение количества жизнеспособных микробных клеток, примерно в 10 и 100 раз соответственно (с 6 до 5 и 4 в логарифмическом выражении обсемененности, что в пересчете на степень обсемененности составляет с 10⁶ до 10^5—4 КОЕ/мл). Наиболее чувствительными к ФДТ оказались F. nucleatum(снижение до 10³ КОЕ/мл), а устойчивыми — P. gingivalis (снижение до10⁴ КОЕ/мл).

При моделировании фотодинамической реакции со штаммами дрожжевых грибов рода Candida установлено следующее. При модифицированном диско-диффузионном методе каких-либо достоверных признаков торможения роста штаммов грибов в зоне фотодинамического воздействия не выявлено. При модифицированном кассетном микрометоде также наблюдали обильный рост колоний грибов.

При использовании метода разведений в нашей модификации получены воспроизводимые результаты. При использовании минимальной концентрации ФС достоверных изменений количества дрожжевых клеток не выявлено. При использовании средней и высокой концентрации ФС отмечено достоверное снижение количества жизнеспособных дрожжевых клеток, примерно в 10—12 раз (с 6 до 4,8 и 4,7 в логарифмическом выражении обсемененности соответственно, что в пересчете на степень обсемененности составляет с 10⁶ до 10⁵ КОЕ/мл).

Со штаммами P. gingivalis и C. albicans проведены эксперименты в динамике с возрастающими экспозициями. Для экспозиций 10, 30, 60, 180, 300 с количество определяемых жизнеспособных клеток составило для P. gingivalis — 6,5, 5,0, 4,0, 6,0, 7,0 соответственно, для грибов кандида — 6,3, 4,0, 5,0, 6,5, 6,7 соответственно.

Таким образом, наблюдалось изменение концентрации клеток бактерий грамотрицательной группы со снижением их количества при экспозиции 10, 30 и 60 с, но с последующим увеличением их размножения при экспозиции 180 и 300 с. У грибов наблюдали эффект снижения до 30 с, а затем наблюдалось увеличение количества популяции вплоть до 300 с. Возможно, выявленные особенности отражают разную чувствительность к фотодинамическому воздействию бактерий с разным строением клеточной стенки, а также различия прокариотической (бактерии) и эукариотической (грибы) клеток.

В результате клинических наблюдений и проведенного анализа установлены следующие закономерности динамики клинико-лабораторных параметров у пациентов двух групп сравнения (по характеру патологии).

Средние значения индекса нуждаемости СPITN у пациентов 1-й группы (хронический катаральный гингивит) до проводимых лечебно-профилактических мероприятий составили 1,14±0,36. После проведенных лечебно-профилактических мероприятий индекс нуждаемости СPITN статистически достоверно значимо снизился в 2,3 раза до 0,49±0,16.

Индекс КПУ за прошедший период не изменился и составил в среднем 11,9±2,73 баллов. У этих же пациентов статистически достоверно значимо уменьшилась бактериальная нагрузка, индекс гигиены (ИГ) в области зубодесневой борозды снизился в 2,7 раза с 1,90±0,62 до 0,70±0,42.

У пациентов 2-й группы (хронический пародонтит) средние значения индекса нуждаемости СPITN в течение изучаемого периода времени несколько снизились и составили 0,92±0,28 на первом визите и 0,63±0,35 в конце лечения, что было достоверно выше аналогичного показателя в 1-й группе после лечения.

Индекс КПУ не изменился (10,7±3,05 и 10,7±2,73 соответственно). Бактериальная нагрузка (ИГ) снижалась (от 2,10±0,54 до 1,50±0,74 соответственно), но конечный показатель также был достоверно выше, чем в 1-й группе.

Следовательно, в результате ФДТ мы наблюдали полную нормализацию параметров пародонтологического статуса у пациентов с хроническим катаральным гингивитом (1-я группа) и достоверное улучшение у пациентов с хроническим пародонтитом (2-я группа).

Лабораторно-бактериологические данные. При хроническом катаральном гингивите пародонтопатогенные виды обнаружены нами как единичные находки. После ФДТ они не выявлялись ни в одном случае. При хроническом пародонтите частота выявления пародонтопатогенных видов составляла от 27,7 до 77,8%. После курса ФДТ мы наблюдали статистически достоверное снижение чатоты в 2 раза для A. actinomicetemcomitans и почти в 2,5 раза — для T. forsythia. Менее выраженной была тенденция к снижению частоты обнаружения P. gingivalis — с 55,6 до 38,9% (статистически недостоверно).

Вывод. В результате проведенной ФДТ мы наблюдали эрадикацию пародонтопатогенных видов у пациентов с хроническим катаральным гингивитом (1-я группа) и достоверное снижение частоты их обнаружения (за исключением P. gingivalis) — у пациентов с хроническим пародонтитом (2-я группа), что соответствовало благоприятной динамике клинической картины, описанной выше у пациентов обеих групп под влиянием ФДТ.