Применение хромато-масс-спектрометрии для определения антибиотиков и противогрибковых препаратов в сыворотке крови

На сегодняшний день в клинической практике используется ряд физико-химических методов для определения концентраций антибиотиков в биологических материале: колориметрия, спектрофотометрия, флуориметрия, капиллярный электрофорез. Однако по мнению многих авторов оптимальным методом мониторинга концентрации антибиотиков в крови пациентов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), обладающая следующими преимуществами перед названными методами: высокая чувствительность и точность, быстрота получения результатов, возможность работы с малым объемом биоматериала и адаптации методики для других субстанций, относительно невысокая стоимость. Цель исследования — разработка высокоэффективной, быстрой методики на основе ВЭЖХ-анализа с масс-детектированием для определения концентраций некоторых антибиотиков (цефтриаксон, цефаксон, пенициллин G, хлорамфеникол, ципрофлоксацин) и противогрибкового препарата флуконазол в сыворотке крови. Материал и методы. Анализы проводили на жидкостном хроматографе серии 1200 с масс-спектрометрическим квадрупольным детектором 6120 фирмы «Agilent» (США), колонка Zorbax SB-C18 4.6×150 мм 5 мкм. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки с использованием программного обеспечения ChemStation (версия В.03.02 [341] фирмы «Agilent», США). Определение исследуемых препаратов на масс-детекторе проводили по выделенным ионам, соответствующим производным [М+Н]+, в режиме положительных ионов. Результаты. Подобраны оптимальные условия для подготовки образца, оптимальный объем вводимой пробы (50 мкл) и градиент подвижной фазы (0,1% муравьиная кислота — 90% ацетонитрил). Установлено, что для количественной оценки субстанций точные навески цефтриаксона, цефаксона, пенициллина G необходимо растворять в воде, флуконазола, хлорамфеникола - в моногидроксиметане, а ципрофлоксацина — в 0,1M соляной кислоте до конечной концентрации 2 мг/мл. Из полученных стоковых растворов готовили композитный стандарт (включающий все перечисленные субстанции), который смешивали с сывороткой крови, не содержащей рассматриваемых лекарственных веществ. Калибровочные зависимости носили линейный характер в диапазоне концентраций 0,08—20,0 мкг/мл, минимальная выявляемая в сыворотке крови концентрация каждого препарата составила 250 нг/мл. Полное время анализа одного или смеси анализируемых компонентов для разработанной нами методики составило не более 40 мин, что включало в себя пробоподготовку биологического образца, селективное разделение субстанций на хроматографической колонке, регенерацию и последующее уравновешивание колонки для очередного анализа, обсчет данных. Предварительное исследование — определение концентрации лекарственных препаратов в крови четырех детей с почечной недостаточностью, в ходе различных методов заместительной почечной терапии получающих терапию антибиотиками или антимикотиками (ципрофлоксацин, цефаксон, флуконазол) показало, что разработанная методика позволяет идентифицировать и определять концентрации не только каждого лекарственного препарата в отдельности, но и в смеси, в случае одновременного нахождения в сыворотке крови. Применение данной методики в клинической практике позволяет адекватно проводить антибактериальную терапию, изменяя дозу и время введения препарата, добиваясь терапевтических концентраций и избегая токсических доз. В настоящее время нами проводится работа по созданию и внедрению в медицинскую практику методики мониторинга всего спектра антибиотиков и противогрибковых средств, разрешенных для клинического использования в Российской Федерации с помощью хромато-масс-спектрометрического анализа.