Разработка и апробация набора реагентов для определения РНК классического вируса бешенства (Rabies virus) методом ОТ-ПЦР в реальном времени

Бешенство относится к зоонозным заболеваниям с контактным механизмом передачи возбудителя. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики бешенства, в Российской Федерации ежегодно регистрируется 5—12 случаев данного заболевания. В настоящее время для лабораторной диагностики бешенства в качестве основного используется метод флуоресцирующих антител (МФА). Однако данный метод имеет ряд недостатков, основным из которых является зависимость его чувствительности от времени, прошедшего между моментом забора материала и моментом проведения анализа. По данным сравнительного анализа диагностическая чувствительность МФА и метода ОТ-ПЦР в реальном времени сравнимы только в случае проведения анализа ex tempore. В противном случае диагностическая чувствительность метода ОТ-ПЦР в реальном времени существенно выше. Однако, внедрению данного метода в качестве основного мешает как отсутствие зарегистрированных наборов реагентов, так и нерешенные вопросы диагностической чувствительности такого диагностического подхода. В частности отсутствуют данные о диагностических характеристиках тестов при выявлении различных штаммов RABV. Целью нашей работы являлась разработка набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства (RABV) методом ОТ-ПЦР в реальном времени, и оценка его аналитических характеристик. Выбор таргетной области для амплификации и детекции RABV осуществляли в пределах последовательности N-гена. Аналитическая чувствительность системы, оцененная на последовательных разведениях положительного контрольного образца (ПКО) составила 4×103 копий ПКО в мл. Аналитическая чувствительность системы, оцененная на последовательных разведениях штаммов RABV с известной концентрацией составила 0,1—1 LD50/мл. Т.о. аналитическая чувствительность для различных штаммов отличается в 10 раз. Однако данное обстоятельство, по нашему мнению, не является существенным, так как концентрация вирусных частиц в мозговой ткани, используемой в качестве исследуемого материала, существенно выше пороговых значений для любого из исследованных штаммов. При исследовании аналитической специфичности, оцененной с помощью РНК 23 штаммов RABV, РНК из высокотитражных культур 17 видов других вирусов, а также ДНК из мозговой ткани животных и человека, ложноположительных и ложноотрицательных результатов зафиксировано не было. Оценка диагностической чувствительности и специфичности, проведенная на выборке первичного материала от инфицированных вирусом бешенства животных и человека (25 шт.) и от животных, у которых вирус бешенства не был обнаружен (22 шт.), показала 100% совпадение результатов исследования с данными, полученными при помощи МФА. Таким образом, разработанная система в рамках данного исследования продемонстрировала высокие показатели аналитической и диагностической чувствительности, что делает перспективным ее использование в качестве скринингового теста при исследовании животных в рамках эпизоотологического надзора, а также с целью лабораторной диагностики бешенства у людей.