В Российской Федерации в структуре общей смертности на долю инсультов приходится свыше 20% [1]. В возрастной группе 65 лет и старше через полгода после инсульта у 46% пациентов регистрируется когнитивный дефицит, а 26% постоянно нуждаются в посторонней помощи [2]. С учетом коррекции на возраст частота ишемического инсульта (ИИ) у мужчин на 30% выше, чем у женщин [3, 4].
Главным фактором риска развития инсульта является артериальная гипертензия (АГ). Между артериальным давлением (АД) и развитием инсульта существует прямопропорциональная, дифференцированная, прогностически и этиологически значимая связь [5, 6]. В настоящее время активно изучаются и генетические факторы риска развития острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК), в том числе роль генетических полиморфизмов матриксных металлопротеиназ (MMP) [7, 8]. Отвечая за расщепление компонентов внеклеточного матрикса, MMP задействованы во всех реакциях нейровоспалительного каскада, сопровождающих инфаркт мозга [9]. В ряде исследований установлено, что степень поражения при инсульте коррелирует с уровнем экспрессии генов MMP [10, 11]. Однако остается малоизученным вклад взаимодействия генетических полиморфизмов между собой и средовыми факторами при развитии цереброваскулярной патологии.
Цель настоящего исследования — изучение роли генетических полиморфизмов MMP, их ген-генных и генно-средовых взаимодействий при формировании риска развития ИИ у мужчин с АГ.
Материал и методы
Выборка для исследования сформирована на базе Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа (неврологическое и кардиологическое отделения) в 2013—2016 гг. Анализировались результаты обследования 523 мужчин: 201 — с ИИ на фоне АГ и 322 — с АГ, не имеющих острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) в анамнезе (контрольная группа).
Критерии включения: лица русской национальности, уроженцы Центрального Черноземья, не состоящие в родстве между собой, систолическое АД ≥140 мм рт.ст. и/или диастолическое АД ≥90 мм рт.ст.
Критерии невключения: наличие симптоматических и вторичных АГ, печеночной и почечной недостаточности, отказ от участия в исследовании. Более детально критерии включения и невключения были описаны нами ранее [8].
ИИ диагностировался специалистами неврологического отделения клинической больницы Святителя Иоасафа на основании неврологического осмотра, жалоб пациента, КТ или МРТ головного мозга. У мужчин атеротромботический подтип зарегистрирован у 81 (40,29%), кардиоэмболический — у 46 (22,89%), гемодинамический — у 50 (24,87%), лакунарный — у 24 (11,95%). Среди обследуемых не было пациентов с артерио-артериальными эмболиями и инсультом по типу гемореологической микроокклюзии.
Диагноз АГ устанавливался в соответствии с рекомендациями по диагностике и лечению АГ Всероссийского научного общества кардиологов [12]. Для всех респондентов регистрировали индекс массы тела (ИМТ, кг/м2), общий холестерин (ОХС), холестерин липопротеидов высокой (ХС-ЛВП) и низкой (ХС-ЛНП) плотности, триглицериды (ТГ), статус курения, злоупотребление алкоголем. Кровь для биохимического анализа отбиралась после 8-часового голодания, анализ проводился в БОКБ Святителя Иоасафа. Курение определялось как выкуривание одной или более сигарет ежедневно в течение последнего года. Злоупотребление алкоголем определялось как употребление 50 г алкоголя в день в течение 1 года и более [13].
Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом медицинского института НИУ «БелГУ» (протокол №8 от 10 апреля 2013 г.). От всех пациентов было получено информированное согласие на проведение исследования. Клинические характеристики мужчин, включенных в исследование, представлены в табл. 1. Пациенты с инсультом и пациенты с АГ без ИИ сопоставимы по возрасту, ИМТ и курению (p>0,05), однако значимо отличались по показателям липидного профиля и злоупотреблению алкоголем (p<0,05).
Таблица 1. Клинические характеристики пациентов с ИИ и мужчин контрольной группы
| Показатель | Пациенты с ИИ (n=201) | Пациенты без ИИ (n=322) | p |
| Возраст, годы | 58,11±7,09 | 57,18±7,62 | 0,42 |
| ИМТ, кг/м2 | 30,29±5,27 | 31,29±3,95 | 0,17 |
| ОХС, ммоль/л | 5,55 [5,00—6,60] | 5,33 [4,80—6,20] | 0,04* |
| ХС-ЛВП, ммоль/л | 1,17 [0,99—1,60] | 1,30 [1,06—1,55] | 0,04* |
| ХС-ЛНП, ммоль/л | 3,85 [3,10—4,80] | 3,60[2,93—4,20] | 0,002* |
| ТГ, ммоль/л | 2,01 [1,45—2,87] | 1,62 [1,21—2,22] | 0,001* |
| Курение, n (%) | 124 (62,00) | 182 (56,70) | 0,27 |
| Злоупотребление алкоголем, n (%) | 30 (15,23) | 12 (3,92) | 0,001* |
Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа больных (n) и %, среднего значения ± стандартного отклонения (M±SD), медианы и межквартильного размаха (Me [Q1—Q3]); * — статистически значимые отличия между группами.
Следует отметить, что у обследованных мужчин чаще всего регистрировалась тяжелая (39,7%) и умеренная (26,9%) АГ, при этом только 34,9% респондентов постоянно принимали антигипертензивные препараты. Среди осложнений АГ чаще всего встречались кардиальные (54,7%), а у 23,8% мужчин с АГ диагностирована ишемическая болезнь сердца.
Генетический анализ. Пациентам, включенным в исследование, проведено генотипирование семи полиморфных локусов (rs1799750, rs243865, rs3025058, rs11568818, rs1320632, rs11225395, rs652438), отобранных ввиду их регуляторного потенциала и влияния на экспрессию генов [14, 15]. Методы выделения геномной ДНК и генотипирования были представлены нами ранее [8].
Статистический анализ. Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди—Вайнберга проводили с использованием критерия χ2. Связь полиморфных локусов MMP с формированием риска развития инсульта на фоне АГ у мужчин определяли методом логистического регрессионного анализа (доминантная, рецессивная, аддитивная генетические модели) в программе PLINK v.2.050 (https://zzz.bwh.harvard.edu/plink/plink2.shtml). Для SNP rs11568818, rs1320632, rs11225395, rs1799750 и rs3025058, совместно расположенных на хромосоме 11 (314.3 kb), проводили гаплотипический анализ. Частоты комбинаций и их связь с развитием инсульта определяли по ЕМ-алгоритму, гаплотипы с частотой <5% исключались из анализа. Полученные результаты корректировали с помощью адаптивного пермутационного теста, статистически значимым уровнем считали pperm<0,05. Ген-генные и генно-средовые взаимодействия MMP с употреблением алкоголя при развитии инсульта у мужчин оценивали методом Generalized Multifactor Dimensionality Reduction (GMDR) с помощью программного обеспечения GMDR (v0.9, https://www.uab.edu/hcgs/bioinformatics). Отбирались трех- и четырехфакторные модели взаимодействий, воспроизводимость (CVC) которых составляла не менее 9/10, а точность предсказания (TBA) — >55%, при уровне значимости p≤0,0107. Полученные результаты валидировались проведением пермутационного теста, выполнялось 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает pperm<0,001. Характер и силу взаимодействия генов MMP между собой и с факторами среды при формировании риска развития инсульта оценивали в % энтропии методом MDR, далее взаимодействия визуализировали в виде графа (программа MDR, vers. 3.0.2) (https://sourceforge.net/projects/mdr).
Результаты
Частоты аллелей и генотипов в обеих группах для всех однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) соответствовали равновесию Харди—Вайнберга (p>0,05) и были сопоставимы с частотами по этим локусам в европейских популяциях. Результаты логистического регрессионного анализа представлены в табл. 2. Полиморфный локус rs3025058 ассоциирован с ИИ у мужчин в доминантной и аддитивной моделях (pperm=0,03) и оказывает протективное влияние при развитии заболевания (OR=0,63—0,74).
Таблица 2. Ассоциации генотипов полиморфных локусов генов MMP с риском развития ИИ на фоне АГ у мужчин
| Полиморфизм | Модель | OR (95% ДИ) | pperm |
| rs11568818 MMP7 | Доминантная (AG/GG vs AA) Рецессивная (GG vs AG/AA) Аддитивная (AG vs GG vs AA) | 0,76 (0,51—2,14) 0,71 (0,42—1,19) 0,79 (0,60—1,05) | 0,18 0,19 0,11 |
| rs1320632 MMP8 | Доминантная (AG/GG vs AA) Рецессивная (GG vs AG/AA) Аддитивная (AG vs GG vs AA) | 1,46 (0,87—2,45) 1,42 (0,27—2,58) 1,39 (0,87—2,20) | 0,15 0,68 0,17 |
| rs11225395 MMP8 | Доминантная (CT/TT vs CC) Рецессивная (TT vs CT/CC) Аддитивная (CT vs TT vs CC) | 0,90 (0,59—1,36) 1,01 (0,79—2,17) 1,03 (0,79—1,35) | 0,61 0,33 0,82 |
| rs1799750 MMP1 | Доминантная (1G2G/2G2G vs 1G1G) Рецессивная (2G2G vs 1G2G/1G1G) Аддитивная (1G2G vs 2G2G vs 1G1G) | 1,31 (0,86—2,01) 1,22 (0,77—1,94) 1,20 (0,91—1,57) | 0,21 0,40 0,19 |
| rs3025058 MMP3 | Доминантная (5A6A/5A5A vs 6A6A) Рецессивная (5A5A vs 5A6A/6A6A) Аддитивная (5A6A vs 6A6A vs 5A5A) | 0,63 (0,42—0,95) 0,72 (0,44—1,18) 0,74 (0,56—0,97) | 0,03* 0,20 0,03* |
| rs652438 MMP12 | Доминантная (GA/GG vs AA) Рецессивная (GG vs GA/AA) Аддитивная (GA vs GG vs AA) | 1,14 (0,65—2,01) 2,10 (0,18—4,36) 1,17 (0,69—1,96) | 0,64 0,55 0,57 |
| rs243865 MMP2 | Доминантная (TC/TT vs CC) Рецессивная (TT vs TC/CC) Аддитивная (TC vs TT vs CC) | 1,29 (0,88—1,90) 1,63 (0,79—3,39) 1,28 (0,94—1,73) | 0,19 0,19 0,12 |
Примечание. OR — показатель отношения шансов, 95% ДИ — его 95% доверительный интервал, * — статистически значимые отличия.
Установлены четыре гаплотипа MMP, частота которых достоверно отличается в группах мужчин с инсультом на фоне АГ и лиц без ОНМК (pperm=0,02—0,03) (табл. 3). Все выявленные комбинации оказывают протективный эффект на формирование инсульта у их носителей (OR=0,48—0,50).
Таблица 3. Гаплотипы MMP, ассоциированные с развитием ИИ на фоне АГ у мужчин
| № | Полиморфные локусы | Частота гаплотипа | OR | pperm | |||||
| rs1320632 MMP8 | rs11225395 MMP8 | rs1799750 MMP1 | rs3025058 MMP3 | rs652438 MMP12 | Пациенты с ИИ (n=203), % | Пациенты без ИИ (n=322), % | |||
| Н1 | C | 1G | 5A | 12,09 | 18,13 | 0,50 | 0,03 | ||
| Н2 | C | 1G | 5A | A | 11,20 | 17,16 | 0,49 | 0,02 | |
| Н3 | A | C | 1G | 5A | 12,31 | 19,08 | 0,50 | 0,03 | |
| Н4 | A | C | 1G | 5A | A | 11,15 | 18,14 | 0,48 | 0,03 |
Примечание. Получено методом логистической регрессии с поправкой на ИМТ, ОХС, ХС-ЛВП, ХС-ЛНП, ТГ, злоупотребление алкоголем.
С помощью метода GMDR установлены четыре наиболее значимые модели ген-генных взаимодействий MMP, связанные с развитием инсульта у мужчин (pperm<0,001) (табл. 4). При этом rs11225395 присутствует во всех выявленных моделях, а сочетание rs1320632 и rs11225395 входит в состав двух из четырех моделей.
Таблица 4. Модели ген-генных взаимодействий MMP, ассоциированные с развитием ИИ у мужчин (n=523)
| Модели ген-генных взаимодействий | OR (95% ДИ) | Test Bal. Acc. (%) | p |
| rs1799750 MMP1×rs3025058 MMP3×rs11225395 MMP8 | 2,55 (1,49—4,37) | 57,00 | 0,01 |
| rs3025058 MMP3×rs1320632 MMP8×rs11225395 MMP8 | 2,45 (1,44—4,18) | 58,70 | 0,01 |
| rs1799750 MMP1×rs1320632 MMP8×rs11225395 MMP8 | 2,19 (1,28—3,74) | 56,93 | 0,01 |
| rs1799750 MMP1×rs11568818 MMP7×rs11225395 MMP8 | 2,40 (1,40—4,11) | 56,60 | 0,01 |
Примечание. Получено методом GMDR с учетом ковариат; Test Bal. Acc. — точность предсказания модели (%), при проведении пермутационного теста выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает pperm<0,001.
При анализе генно-средовых взаимодействий полиморфных локусов MMP со злоупотреблением алкоголем установлены три четырехфакторные модели, ассоциированные с высоким риском развития инсульта у мужчин (OR=2,82—3,11, pperm<0,001) (табл. 5). Следует отметить, что в выявленные комбинации входят rs3025058, rs1320632, rs11225395 и rs1799750, которые ранее демонстрировали межгенные взаимодействия при формировании риска развития инсульта на фоне АГ.
Таблица 5. Модели генно-средовых взаимодействий MMP, ассоциированные с формированием риска развития ИИ у мужчин (n=523)
| Модели генно-средовых взаимодействий | OR (95% ДИ) | Test Bal. Acc. (%) | p |
| Alcohol abuse×rs1799750 MMP1×rs3025058 MMP3×rs11225395 MMP8 | 3,11 (1,83—5,29) | 56,71 | 0,01 |
| Alcohol abuse×rs3025058 MMP3×rs1320632 MMP8×rs11225395 MMP8 | 3,02 (1,78—5,13) | 57,99 | 0,01 |
| Alcohol abuse×rs1799750 MMP1×rs1320632 MMP8×rs11225395 MMP8 | 2,82 (1,65—4,84) | 59,76 | 0,001 |
Примечание. Получено методом GMDR с учетом ковариат; alcohol abuse — злоупотребление алкоголем; при проведении пермутационного теста выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает pperm<0,001.
Сила и направленность взаимодействий между полиморфными генами MMP и злоупотреблением алкоголем при развитии инсульта представлены в виде графа (см. рисунок на цв. вклейке). Показано, что между потреблением алкоголя и rs11225395, rs3025058, rs11568818, rs243865 выраженный антагонистический тип взаимодействий (от –1,70% до –2,24% энтропии). Примечательно, что сочетание rs3025058 и rs11225395 встречается в двух из трех выявленных нами моделей, что подтверждает вклад данных SNP и их взаимодействий с потреблением алкоголя в формирование предрасположенности к инсульту у мужчин.
Граф генно-средовых взаимодействий MMP с алкоголем (ALK) при развитии ИИ у мужчин с АГ.
Цвет линий отражает характер взаимодействия при формировании фенотипа: синий — выраженный антагонизм, коричневый — аддитивное взаимодействие; оранжевый — умеренный синергизм, зеленый — умеренный антагонизм. Сила и направленность взаимодействия выражены в % энтропии.
Таким образом, шесть из семи изученных SNP ассоциированы с развитием ИИ у мужчин, при этом наибольший вклад демонстрируют локусы rs3025058, rs11225395 и rs1799750. Нами не было установлено значимых ассоциаций с развитием инсульта у мужчин rs652438.
Обсуждение
MMP являются одними из основных модуляторов внеклеточного матрикса, обеспечивают протеолиз его компонентов в норме и при патологических процессах, а также расщепляют молекулы клеточной адгезии, нейротрофины и цитокины [16, 17]. Ранняя активация MMP в острую фазу ИИ опосредует гибель нейронов и нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), что ведет к геморрагическому повреждению и инфильтрации воспалительных клеток в область инфаркта [18]. Предшествующие исследования демонстрируют связь генов MMP с развитием сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний [19—25]. В настоящем исследовании установлено, что в формирование риска развития ИИ на фоне АГ у мужчин вовлечены rs3025058, rs11568818, rs1320632, rs11225395, rs652438 и rs1799750, при этом SNP генов MMP3, MMP8 и MMP1 демонстрируют наибольший вклад.
Полиморфный локус rs3025058 MMP3 ассоциирован с развитием ИИ как самостоятельно, так и в составе гаплотипов и моделей ген-генных и генно-средовых взаимодействий (p=0,01—0,03). Данный генетический вариант обусловлен вставкой (6A) или делецией (5A) нуклеотида в положении –1612 промотора гена MMP3, кодирующего одноименный белок. MMP3 является ключевым членом семейства MMP, способным активировать другие протеолитические ферменты, включая MMP1, MMP8, MMP9 и MMP13 [26]. Последние данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия MMP3 в атеросклеротических бляшках приводит к увеличению их уязвимости и разрыву, что является основной причиной ИИ [27]. Полученные нами данные согласуются с исследованиями других популяций. Так, среди итальянского населения частота аллеля 6A rs3025058 была достоверно выше в группе пациентов с ОНМК по сравнению с контрольной группой (OR=1,58, p<0,02) [21], а в работе R. Sherva и соавт. [22] был установлен протективный эффект генотипа 5A/5A rs3025058 при развитии ИИ в американской популяции (OR=0,51, p=0,017). В то же время в исследовании Q. Zhang [23], напротив, не было установлено связи rs3025058 с развитием ИИ, что может быть обусловлено различиями в дизайне исследований.
Генетические полиморфизмы rs11225395 и rs1799750 входят в состав большинства гаплотипов и моделей ген-генных и генно-средовых взаимодействий, ассоциированных с развитием инсульта. Полиморфный вариант rs11225395 обусловлен заменой C на T в позиции –799 промотора гена MMP8, а rs1799750 — вставкой дополнительного гуанина в позиции –1607 промоторного участка MMP1. Согласно данным исследования, в тайваньской популяции rs11225395 MMP8 ассоциирован с развитием ИИ в рецессивной генетической модели (OR=1,24, p<0,01), а также в комбинации со злоупотреблением алкоголем (OR=1,40, p<0,05) [28]. При изучении итальянской популяции G. Ghilardi и соавт. [21] показан синергичный эффект вариантов 2G rs1799750 MMP1 и 6A rs3025058 MMP3 при развитии цереброваскулярной патологии (OR=2,66, p=0,016), что также согласуется с нашими результатами. В то же время в тунисской популяции ассоциация полиморфного локуса rs1799750 MMP1 с заболеваемостью ИИ не достигала статистически значимого уровня (p=0,074) [29]. В доступной печати лишь единичные работы посвящены изучению роли взаимодействий генов MMP между собой и с факторами внешней среды при формировании предрасположенности к ИИ, что диктует необходимость дальнейших исследований этого вопроса. Так, F. Hsieh и соавт. [28] установлено, что комбинированное влияние полиморфных локусов MMP7, MMP8, MMP26 и модифицируемых факторов риска, в том числе курения и употребления алкоголя, значительно повышает риск развития ИИ (OR=5,75, p<0,05).
В настоящем исследовании были установлены генно-средовые взаимодействия MMP со злоупотреблением алкоголем при развитии инсульта. Известно, что алкоголь выступает самостоятельным фактором риска развития церебральных сосудистых заболеваний. Так, в работе K. Reynolds и соавт. [30] установлена связь между употреблением пациентами более 60 г алкоголя в день и относительным риском ИИ (OR=1,69, 95% ДИ 1,34—2,15, p<0,01). Также установлено, что под действием этанола значительно увеличивается концентрация MMP1, MMP2, MMP3, MMP7 [31]. Этанол-индуцированный окислительный стресс в тканях мозга запускает молекулярные каскады, опосредующие активацию MMP, что ведет к нарушению ГЭБ и повышает восприимчивость клеток к ишемическому повреждению [32, 33].
Заключение
Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что в формировании риска развития инсульта на фоне АГ у мужчин значимую роль играют взаимодействия генов MMP между собой и со злоупотреблением алкоголем. Выявлены четыре гаплотипа (pperm=0,02—0,03), четыре модели ген-генных и три модели генно-средовых взаимодействий MMP с алкоголем (pperm<0,001), ассоциированные с развитием ИИ. Установлены направленность и сила взаимодействия между генами MMP и алкоголем при формировании ИИ. Наше исследование имеет некоторые ограничения. Так, в выборку для исследования включались только мужчины; было проанализировано только семь полиморфных локусов шести генов MMP; при анализе генно-средовых взаимодействий не были изучены другие, потенциально значимые средовые факторы риска ИИ.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.