Введение

С момента внедрения молекулярно-генетических методов в исследование микробиома кишечника установилось расхождение получаемых результатов с классическим бактериологическим методом. При этом вместе с ожидаемым обнаружением множества ранее не выявляемых при культивировании форм, при проведении количественных оценок произошло резкое снижение доли микроорганизмов, уверенно определявшихся (при помощи бактериологического метода) в большом числе в кишечном содержимом здоровых людей — прежде всего бифидобактерий, которые достоверно не приобретают патогенных свойств вне зависимости от состояния организма хозяина [1] и роль которых как функционального доминанта в кишечном микробиоценозе надежно установлена [2]. Есть и другие распространенные в микробиоценозах тела человека анаэробные грампозитивные представители того же филума — кутибактерии.

Данные тотального генетического сиквенс-скрининга кишечного микробиома показывали, что представители всего филума Actinobacteria имеют очень небольшое представительство в кишечном микробиоме [3], при этом исследователями идентифицируются зачастую только такие, достаточно аэротолерантные представители этого филума, как кутибактерии (пропионибактерии), коринебактерии и актиномицеты [4]. Получаемые таким образом абсолютные количественные значения численности бактерий, во многом страдают от несовершенства применявшихся методик пробоподготовки микробиомных скринингов как в отношении условий хранения [5], так и выделения [6] материала.

Кроме того, неоднозначность существующих данных по относительной адгезивной способности бифидобактерий к субстратам кишечника и недостаточность данных об их распределении в нем потребовала доработки существующих методов выделения тотальной бактериальной ДНК из различных фракций фекального содержимого кишечника для последующей детекции ее методом ПЦР-анализа. Источником положительных контрольных проб в такой системе может служить наиболее многочисленная, по данным микробиомных молекулярно-генетических исследований, группа анаэробных микроорганизмов — бактероиды.

Цель исследования — определение эффективности некоторых вариантов методики пробоподготовки фекалий для выделения ДНК бифидобактерий, кутибактерий и бактероидов.

Материал и методы

Выделение ДНК для ПЦР-анализа из фекалий обследуемых лиц может быть проведено при помощи набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-B» (ООО «НекстБио», Россия) согласно прилагающейся инструкции [7] или аналогичного, с рядом модификаций на этапе фракционирования исследуемого материала.

В соответствующее пробам количество полипропиленовых микро-пробирок емкостью 1,5 мл вносится 0,8 мл фосфатного буфера (pH=6,0; 60 ммоль/л), либо изотонического раствора хлорида натрия (0,9%). В каждую пробирку вносится 0,1 г исследуемого материала и тщательно смешивается на встряхивателе до образования гомогенной суспензии. Затем пробирки с пробами фекалий центрифугируются 5 мин при не менее чем 10 000 g.

Затем отдельными наконечниками из каждой пробирки отбирается не верхняя светлая, а нижняя темная волокнистая фракция в количестве до 0,05 мл. В качестве источника отрицательных контрольных проб может быть использована взвесь чистой культуры Micrococcus luteus NCTC 2665 как представителя актинобактерий [8], такого же объема.

Отобранные части проб переносятся в новые микропробирки, также содержащие 0,8 мл фосфатного буфера, либо изотонического раствора хлорида натрия соответственно исходным вариантам. После повторного тщательного ресуспендирования на встряхивателе и центрифугировании при не менее чем 10 000 g в течение 15 мин, супернатант удаляется, а осадок ресуспендируется в 0,3 мл фосфатного буфера либо изотонического раствора хлорида натрия соответственно исходным вариантам.

Экстракция ДНК производится путем внесения 0,1 мл подготовленного материала в пробирку с 0,3 мл лизирующего раствора, тщательно перемешивается на встряхивателе и инкубируется при 65 °C в твердотельном термостате ThermoStat Plus (Eppendorf, Германия) в течение 5 мин. Далее раствор центрифугируется при 2000 g в течение 5 с и надосадочная жидкость, содержащая тотальную ДНК, используется для ее дальнейшей экстракции. Универсальный сорбент из используемого комплекта после ресуспендирования вносится в раствор в количестве 25 мкл. Взвесь перемешивается на встряхивателе и инкубируется при комнатной температуре в течение 2 мин и после повторного встряхивания — еще 5 мин. Затем взвесь центрифугируется при 2000 g в течение 30 с, суператант удаляется. После чего к осадку добавляется 0,3 мл «I раствора» для отмывки либо изопропанола. Раствор снова центрифугируется, супернатант удаляется и процедура повторяется однократно. Затем осадок обрабатывается «II раствором» для отмывки либо 70% этанолом по приведенному алгоритму, но центрифугируется при не менее чем 10 000 g в течение 30 с. Процедура также повторяется однократно. Затем сорбент просушивается в открытых пробирках при температуре 65 °C в твердотельном термостате в течение 6 мин, и производится элюция ДНК добавлением к нему 50 мкл ТЕ-буфера. Взвесь перемешивается, инкубируется при 65 °C в твердотельном термостате в течение 5 мин и центрифугируется при 10000 g в течение 1 мин. Надосадочная жидкость, содержащая экстрагированную ДНК, используется в качестве матрицы для постановки реакции амплификации.

Выделенные на предыдущем этапе фрагменты тотальной ДНК из разных фракций исследуемого материала подвергаются стандартной процедуре ПЦР-анализа с электрофоретической детекцией. Для выявления ДНК бифидобактерий и кутибактерий использована разработанная двухфазная экспресс тест-система родовой идентификации данных родов прокариот [9], а также комплект праймеров для родовой идентификации бактерий рода Bacteroides (таблица).

Последовательности праймеров и длины ожидаемых ампликонов, использованные для ПЦР-детекции исследуемых микроорганизмов

Олигонуклеотидные затравки отобраны по консервативным последовательностям гена малой рибосомальной РНК, выровненных методом ClustalW: для идентификации бифидобактерий (Bif F+R) — из геномов Bifidobacterium longum подвида longum, Bifidobacterium longum подвида infantis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium asteroides, и Bifidobacterium animalis; для выявления кутибактерий (Prp F+R) — из геномов вида Cutibacterium acnes; для выявления бактероидов (Btd F+R) — на основе геномов Bacteroides fragillis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Bacteroides helcogenes и Bacteroides salanitronis.

Допускается применение ускоренного двухфазного алгоритма амплификации с объединенной фазой отжига-элонгации при температуре 70 °C длительностью 40 с. Фаза денатурации осуществляется при 92 °C в течение 6 с. Фазы чередуются в течение 60 циклов. Процедура амплификации проводится в программируемом ДНК-амплификаторе.

Получаемые ампликоны подвергаются агарозному гель-электрофорезу. С этой целью 18 мкл раствора, содержащего амплифицированную ДНК, смешивают с 5 мкл буфера для внесения проб в гель, описанном в руководстве [10], 10-кратной концентрации, и вносят в лунки 2% агарозного геля. Электрофорез проводится в TBE- или TAE-буфере однократной концентрации с 50 мкг/мл этидия бромида в качестве люминесцентного красителя ДНК при напряженности поля 10 в/см. Визуализация результатов разделения нуклеиновых кислот проводится в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм.

Результаты и обсуждение

Стандартная процедура выделения фекальной ДНК, описанная производителем набора реагентов, предполагает взятие верхней фракции фекалий после их суспензирования и центрифугирования, и допускает применение различных суспензионных сред: изотонического раствора хлорида натрия или фосфатного буфера. Принимая во внимание данные литературы о высокой адгезивной способности бифидобактерий, выделение тотальной ДНК из различных фракций исследуемого материала с использованием обоих допускаемых суспензионных сред представляется оправданным подходом. Спектрофотометрия выделенной согласно модифицированному протоколу тотальной ДНК демонстрирует ожидаемо низкое качество и небольшое количество вещества, особенно полученного из волокнистой фракции фекалий. Использование фосфатного буфера либо же просто изотонического раствора хлорида натрия в качестве суспензионной среды также не оказывает существенного влияния на эффективность выделения ДНК (рис. 1). В то же время получаемое количество вещества оказывается достаточным для проведения простого ПЦР-анализа.

Рис. 1. Результаты спектрофотометрии образцов растворов ДНК в ПО Nanodrop-8000, выделенной из поверхностной (Surf) и глубокой (Adh) фракций фекалий и с испльзованием фосфатного буфера (Buf) или изотонического раствора хлорида натрия (Sal) для приготовления суспензии.

Проведение ПЦР-анализа при помощи родоспецифичных праймеров к гену малой рибосомальной РНК и с использованием аналогичной системы детекции бактероидов в качестве контроля, показывает, что использование фосфатного буфера или изотонического раствора хлорида натрия на этапе ресуспензирования исследуемого материала не влияет на протекание реакции амплификации. В то же время выделение ДНК из верхней фракции осадка, как рекомендуется производителем набора, не позволяет обнаружить в нем бифидобактерии, тогда как амплификация ДНК бактероидов успешно проходит во всех случаях. ДНК бифидобактерий выявляется только в глубокой волокнистой фазе фекалий (рис. 2).

Рис. 2. Фореграмма ПЦР-детекции ДНК бифидобактерий (A) и бактероидов (B) в поверхностной (1) и глубокой (2) фракциях фекалий с использованием фосфатного буфера (p) или изотонического раствора хлорида натрия (s) для приготовления суспензии.

K — отрицательный контрольный образец на основе ДНК штамма Micrococcus luteus NCTC 2665.

Заключение

Получаемые данные демонстрируют важность учета способности таких индигенных микроорганизмов кишечника человека как бифидобактерии концентрироваться преимущественно в волокнистой части фекалий, не всегда предписываемой в качестве источника выделения бактериальной ДНК руководствами к серийно выпускаемым специализированным наборам реагентов.

Учет указанной особенности пробоподготовки фекального содержимого толстого кишечника человека не требует дополнительных затрат расходных материалов или времени лаборанта и должен способствовать получению более адекватной и репрезентативной картины биоразнообразия микробиоты толстого кишечника человека.

Данные практические рекомендации могут быть полезными для специалистов, занятых в анализе состава микробиома толстого кишечника человека на этапе подготовки проб для проведения молекулярно-генетических исследований.

Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.