Рецепторы к фактору роста фибробластов (FGFR) — это трансмембранные тирозинкиназные рецепторы, связывание которых с лигандами приводит к активации каскадов PI3K-AKT, MAPK-ERK [1]. Ген FGFR2 расположен на хромосоме 10q26, его амплификация связана с усилением сигнальных каскадов и ассоциирована с развитием и прогрессией рака [2]. Таким образом, FGFR2 — это мишень, на которую можно воздействовать при лечении опухолей различных локализаций [3]. FGFR состоит из 3 доменов: экстрацеллюлярного, трансмембранного и интрацеллюлярного. Экстрацеллюлярный домен включает три Ig-подобных части. FGFR2 имеет две формы по третьему Ig-подобному домену: FGFR2 IIIb и FGFR2 IIIc. У мышей без FGFR2 IIIb установлены дисгенезия почек, слюнных желез, надпочечников, тимуса, поджелудочной железы, желез желудка и др., а без FGFR2 IIIc — краниосиностоз, карликовость [4].

В доклинических моделях рака желудка амплификация FGFR2 была связана с повышенной пролиферативной активностью и выживаемостью опухолевых клеток [5].

По данным разных источников [6, 7], амплификация FGFR2 при раке желудка наблюдается в 5—15% случаев. Интересно, что у больных раком желудка с амплификацией HER2 увеличение числа копий гена FGFR2 не наблюдалось [7]. Гиперэкспрессия FGFR2, определяемая иммуногистохимическим (ИГХ) методом, выявлялась в 4—60% случаев при раке желудка в зависимости от используемого антитела и порога позитивности [7—9]. Так же, как и для других маркеров, экспрессия FGFR2 гетерогенна в ряде случаев рака желудка, что может приводить к неверной интерпретации окрашивания [3].

В настоящее время инновационным подходом к терапии распространенного рака желудка является изучение ингибиторов FGFR2. Позитивные результаты клинического исследования 2-й фазы FIGHT привели к ускоренной регистрации Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) моноклонального антитела, блокирующего домен IIIb FGFR2, бемаритузумаба [10, 11]. Позитивные результаты российского клинического исследования фазы 1b позволили инициировать крупное рандомизированное исследование 2-й фазы по оценке эффективности и токсичности аллостерического экстрацеллюлярного ингибитора FGFR2 алофаниба, проявившего активность при обеих изоформах FGFR2 при приемлемой токсичности [12—14]. Учитывая специфичность препаратов и повышение их эффективности у FGFR2-позитивных пациентов, возникает вопрос о необходимости молекулярно-генетического тестирования с возможным последующим отбором кандидатов для таргетной терапии.

Таким образом, оценка статуса FGFR2 при раке желудка — это важная задача, без прояснения которой нельзя выделить когорту пациентов, у которых можно было бы получить наилучший ответ на лечение анти-FGFR2-препаратами.

Материал и методы

В исследование был включен 61 пациент с раком желудка III стадии по классификации TNM (ВОЗ, 8-й пересмотр). Оценку статуса FGFR2 проводили как в первичной опухоли, так и метастазах в лимфатических узлах. ИГХ-исследование FGFR2 было выполнено с использованием 4 коммерчески доступных клонов антител: Abcam clone EPR24075-418, R&D clone 98706, Santa Cruz clone C-8, Abcam clone IG3. Исследование последних трех клонов было выполнено в 17 случаях. Оценку экспрессии в баллах выполняли путем подсчета позитивных клеток (0, 1+, 2+, 3+), а также интенсивности их окрашивания (рис. 1).

Была использована система визуализации Dako EnVision Flex. Для оценки амплификации гена выполняли FISH-исследование с применением зонда ZytoLight SPEC FGFR2/CEN 10 Dual Color Probe. Подсчет проводили в 20 ядрах опухолевых клеток в полях с наибольшей экспрессией FGFR2. Ген считали амплифицированным, если соотношение числа копий гена FGFR2 (зеленые сигналы) к числу копий центромеры 10-й хромосомы (красные сигналы) превышало 2.

Корреляционный анализ ИГХ-экспрессии и амплификации FISH проводили с использованием коэффициента корреляции Пирсона; все значения p<0,05 считали достоверными.

Результаты

При использовании клона Abcam IG3 в различных разведениях было выявлено монотонное окрашивание во всех опухолевых клетках изученных случаев с окрашиванием также эпителия прилежащей нормальной слизистой оболочки. Таким образом, данный клон признан непригодным для оценки экспрессии FGFR2. При проведении реакции с антителами R&D clone 98706, Santa Cruz clone C-8 во всех случаях наблюдалось сильное фоновое окрашивание ядер. Кроме того, в 6 из 8 случаев, в которых при использовании антитела Abcam clone EPR24075-418 была выявлена в той или иной степени позитивная реакция (в том числе два случая 3+, FISH-позитивные), при применении R&D clone 98706, Santa Cruz clone C-8 наблюдалось негативное окрашивание. Оптимальным для исследования был признан клон Abcam clone EPR24075-418.

Позитивная реакция на FGFR2 любой интенсивности была выявлена в 43% случаев рака желудка (табл. 1). Во всех случаях с интенсивностью окрашивания 3+ (рис. 1, г) установлена амплификация гена при проведении FISH-исследования. В 1 из 12 случаев с реакцией 2+ также была выявлена амплификация гена (рис. 2). Во всех иммуногистохимически негативных случаях (см. рис. 1, а) и случаях с окрашиванием 1+ (см. рис. 1, б) амплификация гена выявлена не была. Следовательно, частота амплификации гена FGFR2 при III стадии рака желудка составила 8%.

Таблица 1. Распределение случаев рака желудка по интенсивности экспрессии FGFR2 и результатам FISH

Рис. 1. Иммуногистохимическое исследование FGFR2 клоном EPR24075-418.

а — негативная реакция в опухоли (0); б — окрашивание 1+; в — 2+; г — 3+. ×200.

Рис. 2. Исследование статуса FGFR2 при раке желудка методами иммуногистохимии и FISH.

а — при иммуногистохимическом исследовании выявляется реакция 2+, ×200; б — при проведении FISH-исследования определяется амплификация гена, зеленые сигналы (более 40) — ген FGFR2, красные — центромера 10-й хромосомы, ×1000.

Только в одном изученном случае была выявлена экспрессия во всех опухолевых клетках (3+), в 60 наблюдалась гетерогенность окрашивания (рис. 3). Дискордантность экспрессии между первичной опухолью и метастазом в лимфатическом узле наблюдалась у 13 (21%) пациентов (см. рис. 3, а, б). Повышение экспрессии в метастазе было в 5 случаях (38%), понижение — в 8 (62%) наблюдениях. Важно отметить, что в одном из дискордантных случаев, где в первичной опухоли интенсивность окрашивания 2+, а в метастазе 3+, при реанализе в первичной опухоли выявлены единичные клетки с экспрессией FGFR2 3+, FISH-позитивные.

Рис. 3. Гетерогенность экспрессии FGFR2 в первичных опухолях и метастазах в лимфатических узлах.

а, в — первичные опухоли: сочетание окрашивания 3+ и негативной реакции ; б, г — метастазы: б — негативная реакция; г— позитивная реакция 3+. Иммуногистохимическая реакция, ×200.

В корреляционном анализе наилучшая зависимость была достигнута между экспрессией во всех опухолевых клетках (3+) и FISH, а также между объединенными группами (3+, 2+) и FISH (табл. 2).

Таблица 2. Зависимость между экспрессией FGFR2 и амплификацией FGFR2

Обсуждение

В настоящий момент существуют несколько антител к FGFR2, которые дают различные результаты ИГХ-окрашивания. В одном из исследований показано, что использование клона 1G3 приводило к позитивной реакции во всех опухолевых клетках, а также в нормальном фовеолярном эпителии. Авторы [14] рекомендуют использовать клон 98706, так как применение ненадлежащего клона может привести к перекрестной реакции с FGFR1. В своей работе на начальном этапе мы применили оба клона и также получили тотальную позитивную реакцию во всех случаях с использованием антитела 1G3. Однако при использовании клона 98706, равно как и C8, результаты тоже оказались неудовлетворительными из-за выраженного фонового ядерного окрашивания и негативной реакции в случаях, где наблюдались амплификация гена FGFR2 и разной степени интенсивности окрашивание с клоном EPR24075-418.

Гетерогенность злокачественных опухолей — одна из основных причин их резистентности к лечению [15]. Эта проблема уже описана для рака желудка при оценке экспрессии HER2 [16], PD-L1 [17]. К сожалению, в нашем исследовании в большинстве случаев, в которых наблюдалась экспрессия FGFR2, была гетерогенность реакции. Как показала наша работа, иногда достаточно единичных опухолевых клеток с экспрессией FGFR2 3+, чтобы они стали доминирующим клоном в метастазе. Однако и обратная ситуация возможна: в 8 случаях установлено понижение экспрессии в метастазе в лимфатическом узле в сравнении с первичной опухолью. Кроме того, в одном из случаев в первичной опухоли была выявлена амплификация гена, которая была «потеряна» в метастазе.

Таким образом, гетерогенность FGFR2 может быть проблемой в поиске случаев с амплификацией гена, когда используется только FISH-метод без предварительного ИГХ-анализа. Однако исследования также показывают, что эффективность анти-FGFR2-препаратов выше у тех пациентов, у которых амплификация FGFR2 наблюдалась более чем в 99% клеток опухоли и уровень ее был высокий (более 5) [18].

По-видимому, в каждом клиническом исследовании, где изучаются препараты, действующие на уровне экстрацеллюлярной части рецептора, статус FGFR2 должен быть оценен как с использованием ИГХ-метода, так и с FISH с последующим поиском зависимости между эффективностью препарата и ИГХ/FISH-статусом пациентов.

Заключение

Клон EPR24075-418 показал наилучший результат в оценке экспрессии FGFR2: корреляция с результатами FISH при реакции 3+ составила 100%. Ввиду высокой гетерогенности экспрессии FGFR2 для ее оценки рекомендуется либо исследовать материал первичной опухоли и метастаза, либо оценивать большой объем первичной опухоли.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г.А. Раскин, М.С. Мухина, И.В. Тимофеев, С.А. Тюляндин, Н.П. Беляк, М.А. Клещев, Р.В. Орлова

Сбор и обработка материала — Г.А. Раскин, М.С. Мухина, Е.Д. Кравцова

Статистическая обработка — Г.А. Раскин, М.С. Мухина

Написание текста — Г.А. Раскин, И.В. Тимофеев

Редактирование — Г.А. Раскин, М.С. Мухина, Е. Д. Кравцова, И.В. Тимофеев, С.А. Тюляндин, Н.П. Беляк, М.А. Клещев, Р.В. Орлова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.