Кадгерины — семейство трансмембранных или мембраносвязанных гликопротеинов, обеспечивающих специфическую кальцийзависимую адгезию клеток [1]. Кадгерины входят в состав межклеточных контактов и играют важную роль в морфогенезе многих тканей и органов [2—4]. Данное семейство включает 5 подсемейств: классические кадгерины 1-го типа, кадгерины 2-го типа, кадгерины десмосом (десмоколлины и десмоглеины), протокадгерины и кадгеринсвязанные белки [5, 6].

Е-кадгерин (эпителиальный кадгерин, кадгерин-1) относится к классическим кадгеринам и получил префикс Е (epithelial), поскольку обнаруживается в эпителиальных клетках в отличие от N-кадгерина (определяется в нервных клетках) и Р-кадгерина (выявляется в плаценте) [7]. Е-кадгерин кодируется геном CDH1; он включает в себя внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный домены [8]. Внутриклеточный домен связывает β-катенин и αЕ-катенин с образованием Е-кадгерин/β-катенин/αЕ-катенинового комплекса, известного как ССС-комплекс [9—13]. ССС-комплекс динамически связан с актиновым цитоскелетом и принимает участие в поддержании полярности, регулировке подвижности и пролиферации эпителиальных клеток [14—17].

Большинство авторов подчеркивают существенную роль Е-кадгерина в канцерогенезе в качестве опухолевого супрессора [18—21]. Как показано в экспериментальных исследованиях, снижение функции Е-кадгерина связано с приобретением клетками мезенхимального фенотипа, усилением миграции, инвазивных свойств [22—25], способности к метастазированию [23, 26, 27].

Помимо функции опухолевого супрессора обсуждаются и другие возможные механизмы участия Е-кадгерина в прогрессии опухолей. На моделях воспалительной карциномы молочной железы показана важная роль Е-кадгерина в интравазации клеток опухоли, поддержании целостности опухолевых эмболов и дальнейшем метастазировании [28, 29]. Опухолевые эмболы — это не просто случайные конгломераты опухолевых клеток, их биология гораздо сложнее, чем предполагалось ранее. Клетки опухолевых эмболов не чувствительны к системной химиотерапии и при этом сохраняют жизнеспособность, что обеспечивает реализацию опухолевого метастазирования. Данные характеристики реализуются в опухолевых эмболах посредством гиперэкспрессии Е-кадгерина, обеспечивающего формирование межклеточных контактов. В исследовании J. Tomlinson и соавт. [30—33] на ксенографтной модели MARY-X воспалительной карциномы молочной железы показано, что Е-кадгерин гиперэкспрессируется в опухолевых эмболах, обеспечивая существование компактных опухолевых структур, подобных клеточным сфероидам. Опухолевые эмболы в этой модели не способны связываться с эндотелиальными клетками благодаря повышенной экспрессии sialyl-Lewis X/A-дефицитного муцина 1, который не может связываться с Е-селектином (основной молекулой адгезии эндотелиальных клеток) [30]. Сочетание гиперэкспрессии Е-кадгерина и неспособности эмболов к адгезии на эндотелиальных клетках облегчает пассивную диссеминацию эмболов. Таким образом, Е-кадгерин может выполнять функцию промотора опухолевой диссеминации [34].

Описанные свойства Е-кадгерина продемонстрированы на ксенографтной модели рака молочной железы [33], культуре клеток плоскоклеточного рака (HSC-3) и клеток саркомы Юинга [35, 36], однако подобных данных для рака желудка в литературе нет. Хотя известно, что в спорадическом диффузном/смешанном раке желудка соматические мутации, вызывающие отсутствие или аномальную экспрессию Е-кадгерина, встречаются в 20—60% случаев [37—40].

Цель работы — определить уровень экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах при раке желудка, сравнить его с уровнем экспрессии в опухоли, установить зависимость экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах от клинико-морфологических характеристик рака желудка.

Материал и методы

В исследовании использованы образцы операционного материала от 280 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка, не получавших в предоперационном периоде химиотерапию или лучевую терапию.

Каждый образец окрашивали гематоксилином и эозином, а также определяли экспрессию Е-кадгерина (использовали клон NCH-38 Dako/Agilent Technologies, США). Постановку иммуногистохимических реакций осуществляли с помощью системы детекции UltraVision Quanto (Thermo Fisher Scientific, США) в иммуностейнере Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific, США). В сомнительных случаях для подтверждения наличия эмболов именно в лимфатических сосудах использовали двойную систему детекции (Double Stain IHC Kit: M&R on human tissue (DAB&AP/Red, Abcam ab210059) с антителами к Е-кадгерину (мышиные, клон NCH-38 Dako/Agilent Technologies, США, окрашивание в коричневый цвет) и подопланину (кроличьи, Abcam, клон EPR22182, Abcam, Великобритания, окрашивание в красный цвет).

Результаты реакций в опухолевых клетках и эмболах оценивали полуколичественным методом по N. Setia и соавт. [41] с использованием светового микроскопа DM2500 (Leica Microsystems, Германия). Методика оценки экспрессии подразумевала разделение случаев на 4 категории: 0 — экспрессия отсутствует; 0,33 — экспрессия слабая, определяется в виде отдельных глыбок в цитоплазме клеток; 0,66 — умеренная или выраженная экспрессия, локализующаяся в цитоплазме клеток и на мембране; 0,99 — умеренная или выраженная экспрессия, локализующаяся только на мембране клеток.

Полученные результаты были сопоставлены с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка (гистологический тип по классификации ВОЗ, 2019 г., гистологический тип по классификации P. Lauren, клиническая стадия, глубина инвазии (Т), количество метастазов в лимфатических узлах (N), наличие/отсутствие отдаленных метастазов (М), локализация опухоли в желудке).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Statistica 10 (StatSoft, Inc., США). Для статистической обработки результатов использовали критерий Шапиро—Уилка для проверки гипотез о нормальном распределении полученных данных; анализ на основе таблиц сопряженности и критерий χ² Пирсона.

Результаты и обсуждение

Среди 280 случаев рака в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, наличие опухолевых эмболов в лимфатических сосудах отмечено в 137 наблюдениях. Однако в препаратах, окрашенных с помощью иммуногистохимического метода на Е-кадгерин, опухолевые эмболы были обнаружены лишь в 67 случаях, которые использованы для дальнейшего анализа. Остальные 70 случаев из анализа исключены, так как при дорезке иммуногистохимических препаратов эмболы в срезы не попали.

Распределение пациентов по полу и возрасту, а также по клиническим стадиям и гистологическим типам рака (классификация ВОЗ, 2019 г.) представлено в табл. 1.

Таблица 1. Половозрастные характеристики выборки пациентов, распределение по стадиям и гистологическим типам (классификация ВОЗ, 2019 г.)

В анализируемой группе, состоящей из 67 больных, подавляющее большинство составили пациенты от 51 года до 70 лет с III стадией заболевания и преимущественно тубулярным гистологическим типом опухоли.

Экспрессия Е-кадгерина в ткани опухоли (рис. 1) была распределена следующим образом: 0 — 1 (1,5%) случай, 0,33 — 14 (20,9%) случаев, 0,66 — 28 (41,8%) случаев, 0,99 — 24 (35,8%) случая. Таким образом, в подавляющем большинстве наблюдений раки желудка демонстрировали сохранение мембранной экспрессии Е-кадгерина, в том числе если речь идет о дискогезивных раках (мембранная и мембранно-цитоплазматическая экспрессия выявлена в 8 случаях из 17). С другой стороны, среди опухолей с низким уровнем экспрессии Е-кадгерина (0 и 0,33, так называемая аберрантная экспрессия) преобладали дискогезивные раки — 60% (9 случаев из 15). В группе с нормальной экспрессией Е-кадгерина (0,66 и 0,99) дискогезивные раки встречались значительно реже (15%, 8 случаев из 52). Распределение уровней экспрессии Е-кадгерина в опухоли и в опухолевых эмболах по основным клинико-морфологическим параметрам представлено в табл. 2.

Рис. 1. Экспрессия Е-кадгерина различной интенсивности в ткани рака желудка.

а — дискогезивная карцинома желудка; б — отсутствие экспрессии Е-кадгерина в клетках дискогезивной опухоли (0); в — дискогезивная карцинома желудка; г — слабая цитоплазматическая экспрессия Е-кадгерина в клетках дискогезивной опухоли (0,33); д — низкодифференцированная тубулярная карцинома желудка; е — умеренная цитоплазматическая и мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках тубулярной опухоли (0,66); ж — дискогезивная карцинома желудка; з — выраженная мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках дискогезивной опухоли (0,99).

а, в, д, ж — окраска гематоксилином и эозином, ×40; б, г, е, з — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к E-кадгерину, ×40.

Fig. 1. E-cadherin expression in gastric cancer.

Таблица 2. Распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в опухоли и в опухолевых эмболах в разрезе основных клинико-морфологических характеристик опухоли

Во всей выборке в опухолевых эмболах экспрессия Е-кадгерина была значимо выше (p<0,001), чем в опухолевой ткани: 0,33 — 1 (1,5%) случай, 0,66 — 11 (16,4%) случаев, 0,99 — 55 (82,1%) случаев (рис. 2, рис. 3а). При этом не выявлено ни одного случая, где уровень экспрессии Е-кадгерина снижался в эмболах по сравнению с опухолью: в 59,7% случаев наблюдалось увеличение экспрессии Е-кадгерина, а в 40,3% случаев уровень экспрессии в опухоли был идентичен таковому в эмболах. Во всех 40,3% случаев выявлялись варианты нормальной, а не аберрантной экспрессии Е-кадгерина (0,66 и 0,99). Только в одном наблюдении экспрессия Е-кадгерина в эмболах отмечена на уровне 0,33, однако в этом материале реакция в опухолевых клетках отсутствовала полностью.

Рис. 2. Экспрессия Е-кадгерина различной интенсивности в опухолевых эмболах при раке желудка.

а — слабая цитоплазматическая экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола (0,33); б — умеренная цитоплазматическая и мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола (0,66); в — выраженная мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола (0,99); г — выраженная мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола, положительная экспрессия подопланина в эндотелии лимфатического сосуда.

а, б, в — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к E-кадгерину, ×40; г — двойное иммуногистохимическое окрашивание с антителами к E-кадгерину (коричневый цвет) и подопланину (красный цвет), ×40.

Fig. 2. E-cadherin expression in tumor emboli.

Рис. 3. Сравнение экспрессии Е-кадгерина в ткани рака желудка и в опухолевых эмболах в контексте различных клинико-морфологических параметров.

а — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах; б — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах согласно классификации P. Lauren; в — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах различных гистологических типов согласно классификации ВОЗ, 2019 г.; г — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах в зависимости от наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах.

Fig. 3. Comparison of E-cadherin expression in gastric cancer tissue and in tumor emboli depending by clinical and morphological characteristics of gastric cancer

Значимое повышение экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах по сравнению с первичной опухолью отмечено для всех гистологических типов (ВОЗ, 2019 г.): тубулярного (p=0,003), смешанного (p=0,026), дискогезивного (p<0,001), для промежуточного и диффузного типов по классификации P. Lauren (p<0,001) (рис. 3б, 3в). Сравнение экспрессии в эмболах и в опухоли для новообразований, различающихся по глубине инвазии (Т), стадии и локализации, не выявило статистически значимых различий. Повышение экспрессии Е-кадгерина в эмболах по сравнению с опухолями характеризовалось более высоким уровнем значимости при наличии метастазов (N1, N2, N3a, N3b; p<0,001), чем при их отсутствии (N0; p=0,016) (рис. 3г).

При сравнении экспрессии Е-кадгерина между эмболами в контексте различных клинико-морфологических параметров значимые различия выявлены лишь между дискогезивным и смешанным типами (p=0,043). Однако в данном случае уровень значимости приближается к p=0,05 и полученная разница, скорее всего, обусловлена наличием в группе смешанных опухолей одного случая с уровнем экспрессии Е-кадгерина в эмболах 0,33. Этот выброс сделал возможным появление формального различия между группами, которое по своей сути не несет смысловой нагрузки. При сравнении экспрессии Е-кадгерина в эмболах в контексте других клинико-морфологических параметров значимых различий не обнаружено.

Таким образом, в опухолевых эмболах при раке желудка наблюдается значимое увеличение экспрессии Е-кадгерина по сравнению с первичной опухолью, даже в случаях с аберрантной экспрессией белка (0 и 0,33). Вероятно, в этих случаях снижение или отсутствие Е-кадгерина в опухоли обусловлено эпигенетическими механизмами (например, метилированием промотора гена CDH1). Это свидетельствует о том, что экспрессия маркера в опухоли не является константой и может быть отрегулирована самими опухолевыми клетками при необходимости.

Е-кадгерин не только играет роль в поддержании целостности опухолевого эмбола, но и обеспечивает жизнеспособность этих клеток. Экспериментально показано, что Е-кадгерин обеспечивает безъякорный рост (ancorage independent growth) в сфероидах культуры клеток плоскоклеточного рака ротовой полости (HSC-3) и клеток саркомы Юинга [35, 36], причем в последнем примере экспрессия Е-кадгерина увеличивалась при культивировании в условиях безъякорного роста. Безъякорный рост — способность клеток выживать и пролиферировать в отсутствие взаимодействия с внеклеточным матриксом — является одной из характеристик опухолевых клеток. При безъякорном росте сигналы от межклеточных взаимодействий подавляют аноикис (разновидность апоптоза, наступает в ответ на неправильную адгезию клеток с внеклеточным матриксом). Таким образом, Е-кадгерин поддерживает целостность опухолевых эмболов, жизнеспособность и рост опухолевых клеток, ингибирует апоптоз [42] и является важным функциональным звеном метастазирования при раке желудка.

Заключение

Впервые показано значимое увеличение экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах по сравнению с первичной опухолью желудка. Установлено, что наибольшее увеличение экспрессии Е-кадгерина в эмболах характерно для опухолей диффузного типа по классификации P. Lauren, а также для опухолей с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, что доказывает важную роль Е-кадгерина в процессе метастатической диссеминации при раке желудка.

Финансирование

Исследование выполнено в рамках темы 07.08.006 Госзадания НИР МГУ им. М.В. Ломоносова.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В. Данилова

Сбор и обработка материала — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова

Статистическая обработка данных — И.А. Михайлов

Написание текста — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова

Редактирование — П.Г. Мальков

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.