Воздействие алкоголя на организм связано с изменением деятельности нейрохимических систем мозга, регулирующих настроение, определяющих поведение, участвующих в патогенезе психических расстройств [1]. В клинической медицине существует проблема оценки состояния пациентов, злоупотребляющих алкоголем или страдающих алкогольной зависимостью, связанная высокой коморбидностью и тесной взаимосвязью с различными психическими синдромами [2]. Зависимость и злоупотребление алкоголем сопровождаются нарушениями суточного ритма активности [3, 4], формированием абстинентного синдрома, разнообразными неврологическими, психопатологическими расстройствами, вплоть до острых психозов, а также провоцирует множество вторичных патологических изменений на клеточном, органном и системном уровнях [5]. Значительное число людей, имеющих проблемы с алкоголем, испытывают сильную тревожность и нарушения настроения [6]. Существуют значимые различия в функционировании головного мозга у пациентов с алкоголизмом [7]. Согласно отчету Всемирной организации здравоохранения, в период с 2000 по 2017 г. распространенность алкогольной зависимости в Российской Федерации снизилась на 37%, при этом частота злоупотреблений алкоголем сократилась на 57% [8]. Тем не менее распространенность потребления алкоголя остается значительной, со смещением пика массового приобщения к потреблению алкоголя в возрастную группу 14—15 лет [9]. Таким образом, сохраняется актуальным вопрос разработки трансляционных моделей хронического воздействия этанола на организм человека. Преимущественно лабораторные исследования поведенческих механизмов употребления этанола проводились на крысах и мышах [10]. Однако комплекс сложных поведенческих и аффективных расстройств личности невозможно исследовать у ряда животных ввиду ограниченности диапазона поведения и упрощенной нервной системы. Наиболее перспективным считается моделирование на низших обезьянах, в частности на макаках-резус, вследствие близости к человеку в филогенетическом отношении и по социально-поведенческим характеристикам [11, 12], сходства метаболизма этанола [13] и изменений биохимии крови [14]. Низшие обезьяны способны потреблять алкоголь самостоятельно [11, 15], могут быть исследованы в контролируемых экспериментальных условиях в продолжительном режиме наблюдения для изучения поведенческого подкрепления, реакций на стресс и исполнительных функций, что не всегда возможно у людей. Ранее было показано, что определенные молекулярно-генетические и социальные характеристики макак предрасполагают к большему уровню потребления ими алкоголя [12, 16]. Данных, описывающих спонтанное поведение при индивидуальном содержании макак-резус и потреблении алкоголя в условиях свободного выбора, в доступной нам литературе нет.

Цель исследования — выявление параметров спонтанного поведения, ассоциированных с уровнем потребления этанола, на модели у макак-резус со свободным выбором алкоголя.

Материал и методы

Исследование проводилось согласно принципам гуманного обращения с животными, изложенными в директивах Европейского сообщества (2010/63/EC) и Хельсинкской декларации, и было одобрено биоэтической комиссией ФГБНУ НИИ МП НИЦ КУ (протокол №50 от 28.07.20).

Исследование выполнено на 36 клинически здоровых молодых половозрелых самцах макак-резус в возрасте 8—16 лет, содержащихся в питомнике ФГБНУ НИИ МП (Сочи, Россия). Животные были отсажены из вольеров в индивидуальные приматологические клетки из нержавеющей стали в помещение содержания с возможностью прекращения подачи питьевой воды. Между животными имелся зрительный, обонятельный, слуховой контакт без возможности тактильного взаимодействия. Проводили адаптационный период к условиям индивидуального содержания на протяжении 55 сут.

Моделирование потребления алкоголя. На этапе инициации осуществляли подачу алкоголя в поилках с ограниченным по времени (1 ч/сут) доступом к раствору этанола с подсластителем без доступа к воде, концентрацию этанола увеличивали с 1 до 4% вместе с суточным лимитом по этанолу от 0,5 до 2 г/кг/сут на протяжении 31 сут. Далее в течение 32 дней подавали 4% раствор этанола с подсластителем без лимита по потреблению на протяжении 1ч без доступа к воде. На втором этапе поддержания в течение 55 дней животным предоставили круглосуточный доступ к 4% раствору этанола без подсластителя и неограниченный доступ к питьевой воде. Использование 4% раствора этанола в условиях свободного неограниченного выбора между этанолом и водой является оптимальным условием поддержания алкогольной мотивации у макак-резус, что согласуется с работами других авторов [17].

Оценка поведения. Этологические параметры регистрировали у макак-резус в конце адаптационного периода к условиям содержания (фон, 6 сессий), на этапах инициации (8 сессий) и поддержания (8 сессий) формирующейся алкогольной мотивации. Поведение животных регистрировали в первой половине дня вне времени кормления и уборки помещений. Использовали метод временных интервалов с регистрацией 36 элементов этограммы (рис. 1) по S. Camus и соавт. [18] с модификациями, способом «One-Zero» («Да/Нет»). Данный метод позволяет учитывать распространенность поведения разных категорий в единицу времени при непосредственном наблюдении перед клетками индивидуального содержания. Каждое животное за одну сессию наблюдали 10 мин. В бланках регистрировали все показатели поведения за каждые 10 с с интервалом в 5 с для их записи (всего 40 записей). Рассчитывали частоту встречаемости каждого показателя в процентах.

Рис. 1. Профили поведения животных.

Верхний график — фон, средний — инициация, нижний — поддержание алкогольной мотивации. a—j показатели поведения разных категорий: a — общее поведение, b — заместительное, c — сотрясание клетки, d — поведение по отношению к наблюдателю или соседу, e — стереотипное поведение, f — самоповреждение, g — поддерживающее и пищевое поведение, h — положение в клетке и относительно к наблюдателю, i — поза, j — половое поведение.

Образцы крови брали из подкожной вены плеча утром до кормления животных без седации. Методом иммуноферментного анализа определяли содержание гормонов (кортизол, дегидроэпиандростерон сульфат (ДГЭА-С), наборы ООО «ХЕМА», Москва, анализатор MultiskanEX, «ThermoElectron Corporation», Германия) в сыворотке крови в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам.

Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 7.0 (США). На основании медиан суточного уровня потребления этанола на этапе формирования животные были разделены на квартили и выделены три подгруппы: высокого (ВПЭ, четвертый квартиль), среднего (СПЭ, два промежуточных квартиля) и низкого (НПЭ, первый квартиль) потребления этанола. Статистическую значимость отличий этологических показателей оценивали по тесту Краскела—Уоллиса с поправкой по Данну, что было обусловлено ненормальным характером распределения данных. Наименьший критический уровень значимости α=0,05.

Результаты

Профиль поведенческой активности всех макак-резус на разных этапах опыта приведен на рис. 1. Визуально значительных изменений профиля поведения у 36 макак-резус на разных этапах опыта не наблюдали, что не позволяет судить о влиянии потребления алкоголя на спонтанное поведение в изученной группе животных в целом. Однако уровень потребления раствора алкоголя значительно отличался у индивидуальных животных. Для анализа мы выделили три подгруппы животных, разделив их по медиане уровня потребления на этапе поддержания алкогольной мотивации животных на квартили и объединив два центральных квартиля. В подгруппе НПЭ медиана потребления этанола составила на этапе инициации 0,69 г/кг/сут (95% ДИ 0,60—0,79 г/кг/сут), на этапе поддержания 0,25 г/кг/сут (95% ДИ 0,23—0,28 г/кг/сут). В подгруппе СПЭ медиана потребления этанола на этапах инициации и поддержания составила 0,93 (95% ДИ 0,87—1,02 г/кг/сут) и 0,87 (95% ДИ 0,83—0,90 г/кг/сут) г/кг/сут соответственно. В подгруппе ВПЭ медиана потребления составила 1,70 (95% ДИ 1,63—1,77 г/кг/сут) и 1,79 (95% ДИ 1,73—1,86 г/кг/сут) г/кг/сут соответственно для этапов инициации и поддержания. Ранее нами было установлено, что уровень потребления этанола на этапе поддержания алкогольной мотивации является стабильным длительное время при отсутствии ограничений доступа к пище и объема предоставленного раствора этанола [11]. Это согласуется с результатами других авторов [19]. Поэтому наблюдение за поведением на этом этапе было ограничено периодом в 55 дней, что достаточно для статистической оценки уровня потребления.

При анализе данных поведения в зависимости от уровня потребления животными были выявлены различия по ряду параметров.

В исследовательской активности не было выявлено различий между подгруппами в фоновом периоде (рис. 2, а). Исследовательская активность возросла в подгруппах с низким и средним уровнями потребления на этапе инициации и достигла двукратного уровня на этапе поддержания по сравнению с фоновым периодом. В подгруппе ВПЭ значение этого параметра оставалось на уровне фоновых значений.

Рис. 2. Параметры спонтанного поведения макак-резус подгрупп с различающимся уровнем потребления этанола на этапах «фон» (ф), «инициация» (и), «поддержание» (п)

*, ** — p<0,05, p<0,01, сравнение с периодом «Фон». ^#, ^##, ^### — p<0,05, p<0,01, p<0,001, сравнение между группами.

Заместительное поведение, определяемое по параметрам «почесывание», «зевание» и «чмоканье губами», характеризовалось уменьшением частоты во всех подгруппах от фоновых значений к этапу поддержания алкогольной мотивации (рис. 2, б, в, г).

Повышенная частота агрессии наблюдалась в подгруппе СПЭ в фоновом периоде, а на протяжении опыта статистически значимо снизилась, но была выше, чем в двух других подгруппах (рис. 2, д). Агрессивное поведение реже регистрировали и в подгруппе НПЭ на этапе поддержания, по сравнению с фоновым периодом. Отличий по атипичному поведению, оцененному по частоте откусывания ногтей, не наблюдали в фоновом периоде и на этапе инициации (рис. 2, е). Но в подгруппах СПЭ и ВПЭ в периоде поддержания частота атипичного поведения была выше по сравнению с подгруппой НПЭ.

Наблюдалось значительное увеличение частоты стереотипий на этапе инициации и поддержания в подгруппе ВПЭ (рис. 2, ж). У животных НПЭ и СПЭ частота стереотипий не отличалась на всех этапах и была в 2 раза ниже на этапе поддержания в сравнении с подгруппой ВПЭ.

Подгруппа НПЭ характеризовалась наименьшей частотой груминга на всех этапах опыта (рис. 2, з). Наибольшая частота груминга на этапе фона наблюдалась у животных подгруппы ВПЭ, в 2 раза превышая значение этого параметра для подгруппы НПЭ. На этапе инициации сохранилась повышенная частота груминга в подгруппе ВПЭ относительно подгруппы НПЭ. На этапе поддержания частота груминга в подгруппе ВПЭ не отличалась от других групп, а в подгруппе СПЭ частота груминга значительно увеличилась по сравнению с фоновым периодом.

Касательно предпочтений положения в клетке исходно наблюдались значительные межгрупповые различия (рис. 2, и, к, л, м). Так, животные подгруппы ВПЭ значительно чаще находились внизу клетки и в сидячей позе. Причем эти различия сохранялись на протяжении всего опыта, т.е. не зависели от уровня потребления алкоголя, за исключением уменьшения частоты нахождения наверху на этапе поддержания в подгруппе СПЭ. Такие параметры, как нахождение сзади клетки и положение стоя на всех четырех лапах, исходно не различались между группами. Однако на этапах инициации и поддержания алкогольной мотивации в подгруппе ВПЭ наблюдалось значительное уменьшение частоты пребывания сзади и увеличение частоты нахождения на всех лапах.

Изменения содержания кортизола и ДГЭА-С в крови макак-резус приведены в таблице. Выявлено статистически значимое снижение кортизола в группах при увеличении потребления этанола (p=0,02 в тесте χ² на тренд).

Содержание кортизола и ДГЭА-С в крови макак-резус

Примечание. ¹ — p=0,02 в тесте χ² на тренд снижения кортизола в группах при увеличении потребления этанола. * — p<0,05 по сравнению с периодом «Фон». ^# — p<0,05 по сравнению с группой НПЭ.

Обсуждение

Известно, что добровольное потребление этанола при содержании животных в одиночных клетках больше, чем в социальной среде (в среднем 1,24 г/кг/ч в условиях одиночной клетки и примерно 0,3 г/кг/ч в условиях социальной группы) [20, 21]. Показано, что разовая доза алкоголя 0,67 г/кг приводит к уровню этанола в крови в среднем около 1‰ [22]. Ранее нами выявлена корреляция суточного потребления алкоголя животными с уровнем этанола в их крови [11]. Потребление 4% раствора выше 2 г/кг/сут в нашей модели приводит к уровню этанола в крови, соответствующему легкой степени опьянения у человека (от 0,5 до 1,5‰), когда преобладает психическое возбуждение над торможением и увеличивается амплитуда эмоциональных реакций, появляются неустойчивость внимания и нетерпеливость. Подобный уровень содержания этанола в крови мог быть достигнут только у животных подгруппы ВПЭ. Вероятно, со степенью опьянения в данной подгруппе связано уменьшение частоты пребывания сзади клетки и увеличение частоты нахождения на всех лапах. Кроме того, в подгруппе ВПЭ наблюдалось увеличение частоты стереотипий на этапе инициации и поддержания. Подобный эффект этанола, вероятно, обусловлен его влиянием на центральную дофаминергическую систему [23]. Известно, что активация дофаминовых рецепторов сопряжена с увеличением стереотипного поведения у макак [24]. Следовательно, можно предположить, что изменения стереотипного поведения связаны с активацией дофаминергических систем мозга в группе высокого потребления.

Увеличение частоты атипичного поведения в группах СПЭ и ВПЭ в периоде поддержания свидетельствует об отрицательном биологическом эффекте этанола уже в дозах, вызывающих незначительную степень опьянения.

Частота заместительного поведения и агрессии снизилась во всех подгруппах от значений фона к этапу поддержания алкогольной мотивации, что может быть обусловлено анксиолитическим действием этанола [25]. Это подтверждается снижением уровня кортизола в сыворотке крови в подгруппах СПЭ и ВПЭ. При этом считается, что разовая доза этанола может приводить к активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, хроническое добровольное потребление этанола у низших обезьян слегка подавляет базальную активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, а результаты, полученные у людей, противоречивы [26]. Было показано, что у лиц, находящихся в состоянии алкогольного опьянения различной степени, наблюдается уменьшение содержания кортизола в крови [27]. Таким образом, наши данные согласуются с результатами других исследований, показавших угнетающее действие этанола на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему.

Заключение

Таким образом, на модели свободного потребления алкоголя макаками-резус наблюдается значительное изменение ряда параметров спонтанного поведения в зависимости от уровня потребления этанола, включая заместительное, стереотипное поведение и позу животных. Для оценки динамики выявленных изменений поведения требуется их изучение при более длительном наблюдении на этапе формирования и в периодах абстиненции. Изменения в поведении ассоциированы с изменением функционирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и другими центральными эффектами этанола.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.