В последние годы наблюдается возрастание интереса к изучению роли кинуренинового пути метаболизма триптофана в патогенезе шизофрении [1, 2]. Продукты метаболизма триптофана оказывают влияние на функцио­нирование глутаматергических нейронов. Кинурениновая кислота, в частности, является антагонистом рецепторов глутамата типа NMDA. Этот метаболит блокирует рецепторы, что ведет к снижению активности глутаматергической системы, которой отводится существенная роль в механизмах развития заболевания.

Триптофан - одна из незаменимых аминокислот, поступающих в организм человека преимущественно с белковыми компонентами пищи. Аминокислота и ее метаболиты участвуют в различных процессах, регулирующих функции большинства клеток. При этом характер регуляции во многом зависит от особенностей обмена триптофана, определяемых конкуренцией между разными путями его деградации. Метаболизм триптофана в организме может проходить по пути метоксииндольному (ведет к образованию серотонина и мелатонина) и кинурениновому. В последнем случае образуются метаболиты, обладающие нейротоксическим действием (кинуреновая кислота, 3-гидроксикинуренин, хинолиновая кислота), повышенные концентрации которых обнаружены в крови и цереб­роспинальной жидкости больных шизофренией [3-5].

Выбор пути, по которому пойдет метаболизм триптофана, определяется многими факторами. В качестве одного из них выступает наличие легкого воспалительного процесса, имеющего место при шизофрении [6]. Такое предположение обосновано тем, что на первом этапе кин­уренинового пути триптофан превращается в кинуренин с помощью фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), а индуктором IDO являются провоспалительные цитокины. Ранее считалось, что основным стимулятором IDO является γ-интерферон [7, 8]. Однако в недавнем исследовании было обнаружено, что в культуре гиппокампальных нейронов линии HPC03A/07 активатором экспрессии IDO и увеличения уровня кинуренина был интерлейкин-1β (IL-1β) [9].

Цель настоящего исследования - изучение полиморфизмов в кодирующих эти белки генах для поиска их ассоциации с шизофренией. В случае обнаружения ассоциации и соответственно вариантов риска предполагалось исследовать возможность использования этих вариантов или их комбинаций в целях генетического тестирования на предрасположенность к шизофрении.

Для исследования гена IL-1β были выбраны полиморфные локусы (полиморфизмы) T-511C (rs16944) и C3954T (rs1143634), а для гена IDO - VNTR^[1] и rs9657182. Локус T-511C расположен в области промотора, а C3954T - в экзоне 5 гена. Полиморфизм обусловлен заменой ти­мина (Т) на цитозин (С). Оба полиморфизма являются функциональными, т.е. при замене нуклеотидов имеет место изменение экспрессии соответствующего белка. Минорные аллели, т.е. аллели с более низкой популяционной частотой, связывают с более высокой продукцией белка, т.е. высокая активность характерна для аллелей Т [10]. Локусы VNTR и rs9657182 расположены в области промотора гена. Полиморфизм VNTR обусловлен разным числом повторов, состоящих из 24 п.о., а rs9657182 - заменой Т на С. По данным литературы [11], полиморфизм VNTR не оказывал влияния на транскрипционную активность, индуцированную цитокинами, in vitro, но некоторые данные указывают на его роль в поддержании баланса триптофана. Полиморфизмы гена IL-1β ранее использовали для поиска ассоциации с шизофренией [10-14], полиморфизмы гена IDO в этом аспекте будут изучены впервые.

В исследование были включены 296 больных с параноидной шизофренией (рубрика F20.0 по МКБ-10). Среди них было 114 (38,5%) женщин и 182 (61,5%) мужчины. Средний возраст обследованных был 40,6±14,0 лет, средний возраст к началу заболевания 25,1±9,7 года.

Контрольная группа включала 355 человек без психических заболеваний - 199 (56,1%) женщин и 156 (43,9%) мужчин, средний возраст которых был 33,5±13,0 лет.

Все обследованные были этнически русские, давшие информированное согласие на участие в исследовании.

Молекулярно-генетическое исследование включало выделение ДНК из венозной крови больных и проведение генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим разделением полученных фрагментов с помощью электрофореза. ДНК из венозной крови выделяли стандартным фенол-хлороформным методом. Для определения аллельного полиморфизма 511T>C гена IL-1β проводили ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямой - 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3', обратный - 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3'. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкМ каждого из праймеров, 10× буфер для Taq-полимеразы («Helicon»). ПЦР проводили по следующей схеме: денатурация в течение 2 мин при 94 °C, далее - 30 циклов амплификации (94 oC - 20 с; 58 oC - 20 с; 72 oC - 20 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 4 мин. Рестрикцию проводили с помощью фермента Ama87I (фирма «Сибэнзим») в условиях, рекомендованных производителем. Разделение полученных фрагментов осуществляли в 8% полиакриламидном геле в течение 1 ч при 240V. Размер фрагмента, полученного в результате амплификации, составлял 305 пар оснований (п.о.). После проведения рестрикции наличие фрагмента величиной 305 п.о. свидетельствовало о присутствии гомозиготных аллелей TT, наличие фрагментов величиной 190 и 115 п.о. - гомозиготных аллелей CC. Наличие трех фрагментов величиной 305, 190 и 115 п.о. свидетельствовало о гетерозиготном генотипе TC.

Для определения полиморфизма C3954T гена IL-1B проводили ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямой - 5'-CTCAGGTGTCCTCGAAGA AATCAAA и обратный -5'-GCTTTTTTGCTGTGAGTC CCG. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкМ каждого из праймеров, 10× буфер для Taq-полимеразы («Helicon») и (формамид или DMSO). Денатурацию проводили в течение 4 мин при 96 oС, далее - 35 циклов амплификации (95 oC - 30 с; 58 oC - 40 с; 72 oC - 25 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 2 мин. Рестрикцию проводили ферментом Taq («Fermentas» или «Сибэнзим») в условиях, рекомендованных производителем. Разделение фрагментов осуществляли в 3,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия в течение 1 ч при 240V. После рестрикции получали фрагмент длиной 164 п.о. (генотип ТТ) и фрагменты 52 и 112 п.о. (генотип СС). На наличие гетерозиготного генотипа TC указывало наличие трех фрагментов величиной 305, 190 и 115 п.о.

Для определения полиморфизма IDO VNTR использовали олигонуклеотидные праймеры: прямой - 5'-AAT CCTGGGACAGAATCATC и обратный -5'ATGAGGCTA ATACTTTGGG. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкМ каждого из праймеров, 10×буфер для Taq-полимеразы («Helicon») и 0,8M бетаина. Денатурацию проводили в течение 4 мин при 94 oС, далее - 30 циклов амплификации (94 oC - 30 с; 53 oC - 30 с; 72 oC - 30 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 2 мин. Разделение полученных фрагментов осуществляли в 8% поли­акриламидном геле в течение 1 ч при 240V. Размеры фрагментов составляли: 208 п.о. (аллель V1) и 232 п.о. (аллель V2).

Для полиморфизма IDO rs9657182 использовали олигонуклеотидные праймеры: прямой - 5'-TGCTCCAAA ATTATATGAGATTCC и обратный -5'GACACAACACTT TAGGATTTGCA. Состав реакционной смеси был тот же, что и для полиморфизма IDO VNTR. Денатурацию проводили в течение 4 мин при 94 oС, далее - 30 циклов амплификации (94 oC - 30 с; 61 oC - 30 с; 72 oC - 30 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 2 мин. Рестрикцию проводили ферментом Bsp19I («Сиб­энзим») в условиях, рекомендованных производителем. Разделение фрагментов осуществляли в 8% полиакрил­амидном геле в течение 1 ч при 240V. После рестрикции получали фрагмент длиной 232 п.о. (генотип CC) и фрагменты 90 и 142 п.о. (генотип TT). На наличие гетерозиготного генотипа TC указывало наличие трех фрагментов величиной 232, 90 и 142 п.о.

Статистическая обработка включала в себя построение таблиц сопряженности с использованием критерия &khgr;² для оценки значимости различий. Для расчета риска использовали показатель отношение шансов (ОШ) с приведением доверительного интервала при вероятности 95% (95% ДИ). Для поиска комбинаций вариантов применяли программу MDR (Multiple Dimensions Reduction), с помощью которой можно подобрать оптимальную комбинацию генетических вариантов, связанную с риском заболевания. Также эта программа позволяет оценить чувствительность^[2] и специфичность^[3] использования комбинации в качестве маркера предрасположенности к заболеванию. На основании этих показателей рассчитывали усредненную величину (AUC) по формуле: (чувствительность + специфичность)/2, с помощью которой можно качественно оценить прогностическую ценность маркера^[4].

Распределение аллелей и генотипов по полиморфизмам в группах больных шизофренией и психически здоровых представлено в табл. 1-4.

Таким образом, результаты работы указывают на существование связи между генами IL-1β и IDO и шизофренией. Эти результаты вполне согласуются с высказанным предположением, которое опиралось на кинуренин-кин­уреновую гипотезу происхождения шизофрении и экспериментальные биохимические данные о роли IL-1β и IDO в кинурениновом пути метаболизма триптофана [9]. При изучении полиморфизмов IL-1β T-511, IL-1β C3954T, IDO VNTR, IDO rs9657182 в группах больных шизофренией и психически здоровых мы обнаружили комбинацию С-Т-V1-С. Эта комбинация значимо чаще встречалась в группе больных по сравнению с контролем. У ее носителей риск развития шизофрении был в 3,3 раза выше, чем у носителей других генетических вариантов. В комбинацию вошли аллель С (IL-1β T-511С) и аллель Т (IL-1β C3954T), которые и ранее изучали у больных шизофренией. Метаанализ нескольких исследований, в сумме включающий 819 больных шизофренией и 1292 психически здоровых, показал существование ассоциации (ОШ 1,24) между аллелем С полиморфизма T-511С и заболеванием у европеоидов [10]. Полученные нами результаты подтверждают эти данные. Связь между шизофренией и полиморфизмом C3954T ранее изучалась только в азиатских популяциях [15, 16], но результат был негативный. Что касается гена IDO, то, как уже упоминалось, полиморфизмы этого гена никогда не изучали у больных шизофренией. В нашем исследовании впервые было обнаружено, что вариантами риска являются аллели V1 и С. Нужно отметить, что полиморфизм IDO rs9657182 ранее использовали при изучении генов психических заболеваний. Например, по данным работы [17], аллель С был связан с риском развития депрессии у больных гепатитом С, для лечения которых применяли интерферон-α.

Оценка возможности использования комбинации С-Т-V1-С в качестве маркера риска шизофрении показала, что для него характерны высокая (более 80%) чувствительность, но низкая (в пределах 60-70%) специфичность и соответственно средний уровень прогностической ценности.

На основании этих показателей можно сделать заключение о возможностях и ограничениях использования маркера в практических целях. К его достоинствам можно отнести высокую чувствительность, которая необходима, если важно выявить как можно больше лиц, имеющих предрасположенность к шизофрении, при проведении, например, медико-генетического тестирования или скрининговых исследований. К ограничениям следует отнести низкую специфичность, т.е. повышенную вероятность выявления ложноположительных случаев в группе здоровых людей. Исходя из этих данных, представляется целесообразным рекомендовать использование выявленного генетического маркера для выявления групп ультравысокого риска по шизофрении, т.е. в случаях, когда основной задачей является выявление лиц с генетической предрасположенностью к заболеванию для дальнейшего наблюдения.

Работа выполнена при частичной поддержке грантом РФФИ №12-04-00108-а.