Начиная со второй половины XX века во всем мире наблюдается изменение возрастной структуры населения с постоянным увеличением в популяции доли пожилых и старых людей. Нарушение памяти и другие когнитивные расстройства в старших возрастных группах встречаются нередко, что объясняется чрезвычайно высокой распространенностью болезни Альцгеймера (БА), а также заболеваний сердечно-сосудистой системы, особенно артериальной гипертензии [1]. В связи с этим в современной медицине приобретают все большее значение профилактика и лечение большого числа возрастзависимых заболеваний, прежде всего деменции и недементных когнитивных нарушений [2].

Среди церебральных структур, формирующих когнитивные функции в целом и память в частности, ключевую роль играет гиппокамп. Согласно теории системной динамической локализации высших мозговых функций А.Р. Лурия, гиппокамп входит в первый из трех условно выделяемых в головном мозге функциональных блоков, обеспечивая активацию коры головного мозга в ответ на внешнюю стимуляцию или внутреннюю мотивацию; кроме того, специфической функцией гиппокампа является сопоставление вновь поступающих стимулов с прежними, что играет большую роль в процессе усвоения новой информации [2]. При патологии гиппокампа и функционально связанных с ним структур развиваются нарушения памяти на текущие события [2].

В современной научной литературе сведения об изменениях гиппокампа в постнатальном онтогенезе немногочисленны [3, 4]. Некоторые авторы обозначают в качестве его возрастных изменений наличие перицеллюлярного отека, особенно в ганглионарном слое, липофусциноза нейронов, сосудистых расстройств (стаз, полнокровие), появление участков дистрофического обызвествления [5]. Также отмечается изменение морфометрических парамет­ров гиппокампа с возрастом, выражающееся в уменьшении ширины пирамидного слоя, удельной плотности нейронов в молекулярном и пирамидном слоях, изменении морфометрических параметров нейронов, уменьшении количества тормозных нейронов [5, 6].

Известно, что дегенеративные процессы в мозге сопровождаются регенераторными изменениями. Самым значительным результатом регенеративной нейробиологии на рубеже ХХ и ХХI столетий явилось открытие нейральных стволовых клеток (НСК), обеспечивающих гомео­статическую и адаптивную регенерацию нейронов в ЦНС [7]. Феномен нейрогенеза считается доказанным для трех областей мозга: зубчатой извилины гиппокампа (субгранулярная область, или зона - СГЗ, SGZ), субвентрикулярной области (боковые стенки боковых желудочков мозга - СВЗ, SVZ) и коры мозжечка [8]. При этом интенсивность нейрогенеза в герминативных зонах зависит от возраста и функциональной активности и изменяется в условиях патологии: активизация этого процесса способствует адаптации организма к изменяющимся условиям и позволяет частично компенсировать последствия патологических изменений [7]. Тем не менее остается много неясных моментов в концепции постнатального нейрогенеза, а именно его интенсивность и эффективность в различные возрастные периоды и при дегенеративных процессах в ЦНС, что и определило актуальность нашей работы.

Цель настоящего исследования - изучить сопровож­дающие старение человека дегенеративные и регенераторные изменения в гиппокампе.

Изучили аутопсийный материал в 50 случаях гибели людей 25-89 лет от случайных причин, не связанных с повреждениями или патологией головного мозга. Согласно возрастной периодизации человека, изучаемый контингент отнесен к разным возрастным категориям [1]: первый зрелый возраст - 22-35 лет (10 человек), второй - 36-56 лет (14), пожилой - 57-74 года (13) и старческий - от 75 лет (13).

Гиппокамп подвергали гистологическому исследованию в соответствии с общепринятыми методиками при окраске гематоксилином и эозином. По результатам микроскопирования осуществляли отбор препаратов для проведения иммуногистохимических исследований, которые выполняли по стандартным методикам [9, 10] с докрашиванием срезов гематоксилином Майера. При микроскопии препаратов в гиппокампе выделяли четыре области (поля гиппокампа) - СА1, СА2, СА3, СА4, ориентированные в медиолатеральном направлении [11]. Визуализацию и фотосъемку микропрепаратов проводили на микроскопе Micros (Австрия) в программе Scope Photo. Анализ изображений осуществляли в программе ImageJ. Подсчет количества позитивно и негативно окрашенных клеток проводили в квадратной закрытой тест-системе.

Иммуногистохимическими методами изучали экспрессию следующих маркеров: тау-белка, глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), CD105/эндоглина, Е-селектина, молекулы межклеточной адгезии-1 (NCAM), Cdk2. Для выявления экспрессии маркеров применяли авидин-биотиновый метод. Использовали антитела и полный диагностический набор реагентов, предназначенный для проведения иммуногистохимических экспериментальных исследований («Diagnostic BioSystems», Нидерланды). Результаты реакции оценивали, подсчитывая процент позитивных к каждому исследуемому маркеру клеток в поле зрения микроскопа при увеличении × 600 [12].

Статистический анализ выполнен при помощи программного пакета Biostat. Для оценки существенности различий между выборками (все данные сравнивали с результатами, полученными в группе первого зрелого возраста) использовали критерий Манна-Уитни [13].

В мозге лиц пожилого и в большей степени старческого возраста была выявлена экспрессия тау-белка, что согласуется с общепринятыми представлениями об эпидемиологии БА. В категории лиц старческого возраста у 30,76% группы отмечалась выраженная экспрессия тау-белка в цитоплазме пирамидных клеток (82,88±10,13% окрашенных клеток в поле зрения, p<0,05 по отношению к первому зрелому возрасту, рис. 1), немногочисленные клетки с экспрессией тау-белка выявлены в зубчатой фасции (13,85±3,94%, p<0,05).

Установлено [2], что β-амилоид (Аβ) стимулирует фосфорилирование тау-фибрилл и, следовательно, усугуб­ляет нейродегенеративные процессы при таупатиях, в том числе при БА. Известно [14], что таупатия в мозге пациентов с БА начинается с энторинальной коры, клеток зубчатой фасции и СА1 области гиппокампа. Таким образом, выявленная экспрессия тау-протеина в пирамидных нейронах гиппокампа лиц пожилого и старческого возраста подтверждает существующие представления о том, что БА нередко встречается в этих возрастных группах. Обнаружение экспрессии тау в единичном случае в группе лиц второго зрелого возраста может быть объяснено возможным наличием у пациента хронической травматической энцефалопатии, сопровождающейся накоплением тау-белка или другой таупатией [15].

Мы наблюдали выраженную экспрессию GFAP у лиц старческого возраста в гиппокампе и зубчатой фасции (82,2±10,14% окрашенных клеток в поле зрения, p<0,05 по отношению к группе первого зрелого возраста) и суб­эпендимной области (72,5±6,94%, p<0,05), немногочисленных эпендимоцитах (8,53±0,92%, p<0,05). У лиц пожилого возраста - выраженную экспрессию в субэпендимной зоне (54,31±7,88%, p<0,05), гиппокампе и зубчатой фасции (41,4±7,92%, p<0,05, рис. 2).

Иммуногистохимическую реакцию на GFAP в головном мозге млекопитающих в норме дают типичные астроциты, расположенные во всех областях конечного мозга, а также клетки субэпендимной области [16]. В общепризнанных герминативных зонах мозга - СВЗ и СГЗ - отмечается компактное расположение НСК и прогениторных клеток, которые здесь экспрессируют ряд астроглиальных маркеров, в том числе - GFAP [7]. Недифференцированные стволовые и прогениторные клетки экспрессируют GFAP на поздних стадиях дифференцировки [10]. Согласно другой точке зрения, астроциты в СВЗ и СГЗ выступают в качестве нейральных стволовых клеток у млекопитающих [17].

Известно, что с возрастом в мозге увеличивается количество глиальных клеток (особенно микро- и астроглии), что является возрастным проявлением нейронального воспаления, один из клинических признаков которого - расстройства когнитивных функций, и сопряжено с экспрессией провоспалительных цитокинов: IL-1α, IL-6, TNF-α; микроглия и астроциты тоже могут продуцировать Аβ, который также является провокатором воспалительных реакций [18]. При ишемии в области поражения через 1-2 нед реперфузии появляется множество активированных астроцитов, промежуточные филаменты которых содержат GFAP [16]. Существует мнение, что ишемия головного мозга приводит к увеличению интенсивности реакции на маркеры НСК и GFAP сначала в суб-, а затем и эпендиме, в связи с чем высказывается предположение, что в эпендиме существует популяция стволовых клеток, которые в покое не делятся, а в суб­эпендиме располагаются прогениторные клетки; и ишемия приводит к активации прогениторных клеток, однако, вероятно, если их потенциала не хватает для полного восстановления, то задействуются и стволовые клетки [16]. Таким образом, выявленная экспрессия GFAP свидетельствует об активации глиогенеза у лиц пожилого и старческого возраста и увеличении количества астроцитов. Кроме того, выявление в эпендиме и субэпендимной области клеток, экспрессирующих GFAP, может свидетельствовать в пользу активации не только глио-, но и нейрогенеза, поскольку эти клетки могут являться и глио-, и нейробластами [16].

Экспрессия NCAM/CD56 у лиц первого (рис. 3) и второго зрелого возраста выявлялась исключительно в клетках зубчатой фасции (22,14±4,81 и 24,7±3,92% соответственно).

Экспрессия Cdk2 в первом и втором зрелом возрасте также, как и экспрессия NCAM/CD56, выявлялась исключительно в клетках зубчатой фасции (19,41±3,56 и 21,7±5,82% соответственно). У лиц пожилого возраста выявлена выраженная экспрессия маркера в субэпендимной области (52,28±4,82%, p<0,05) и умеренно выраженная - в зубчатой фасции (24,82±4,48%, p>0,05). У лиц старческого возраста - выраженная экспрессия в суб­эпендимной области (78,5±9,94%) и зубчатой фасции (85,33±9,90%). В эпендиме выявлялись единичные окрашенные клетки (в обеих указанных возрастных группах) (8,45±1,93 и 10,31±2,57% соответственно, рис. 4).

Экспрессия CD105 (маркер новообразованных эндотелиальных клеток) эндотелиальными клетками капилляров в изучаемых структурах мозга также превалировала в группах пациентов пожилого и старческого возраста.

В этих возрастных группах маркер выявлялся в стенках капилляров - в молекулярном и краевом (полиморфный) слоях гиппокампа (рис. 6) - в 89,8±10,34% клеток в группе старческого возраста (p<0,05), в 65,87±7,55% - в группе пожилого возраста (p<0,05), а также в субэпендимной области (41,32±7,5 и 34,85±5,64% соответственно, p<0,05), что может говорить либо о компенсаторном васкулогенезе в ответ на ишемию ткани мозга, закономерную в этих возрастных группах, либо возможности васкулогенеза, сопровождающего нейрогенез.

Известно, что ишемический очаг или травма ЦНС у лабораторных животных и человека уже через 3-4 дня усиливают ангиогенез, т.е. рост и ветвление существующих в ткани сосудов, а также васкулогенез - образование новых сосудов с участием циркулирующих эндотелиобластов, число которых в периферической крови возрастает при повреждении ткани мозга [7]. Тем не менее усиление нейро-, ангио- и васкулогенеза во многих случаях оказывается недостаточным для полноценного восстановления функций, что может быть связано с низкой эффективностью интеграции вновь образовавшихся нейронов в нейронные сети и недостаточной реваскуляризацией [7].

Гиперэкспрессия Е-селектина (CD62E, маркер реактивной активации эндотелия) в эндотелии сосудов мозга, по данным литературы, сопровождает ишемию мозга [19] и свидетельствует в пользу нейронального воспаления, сопровождающего увеличение глиальных клеток в мозге с возрастом [18]. В группе лиц первого и второго зрелого возраста экспрессия Е-селектина обнаружена в эндотелио­цитах единичных капилляров (7,87±1,92% - в слоях гиппокампа и 5,56±1,34% - в зубчатой фасции у лиц первого зрелого возраста; 9,91±0,92% - слоях гиппокампа и 7,78±2,33% - у лиц второго зрелого возраста). У лиц пожилого возраста отмечалась умеренная экспрессия CD62E в эндотелии сосудов гиппокампа (14,09±2,12%, p<0,05) и зубчатой фасции (18,55±4,31%, p<0,05). В категории лиц старческого возраста отмечалась выраженная экспрессия Е-селектина в эндотелии капилляров в слоях гиппокампа (34,55±3,87%, p<0,05) и зубчатой фасции (42,34±6,91%, p<0,05).

Таким образом, экспрессия тау-белка, свидетельствующая о наличии таупатий, в том числе БА, была выявлена у большего процента лиц старческого возраста, нежели в группе пожилых людей; данный маркер локализовался в цитоплазме высокодифференцированных нейронов - пирамидных клеток гиппокампа. Выявление в 1 случае экспрессии тау-белка в группе лиц второго зрелого возраста свидетельствует, возможно, о наличии у пациента посттравматической деменции (или иной таупатии).

При исследовании маркеров нейрогенеза их выраженная экспрессия выявлена у лиц старческого возраста, у лиц пожилого возраста - умеренная. В основном, экспрессия была обнаружена в субэпендимной зоне гиппокампа и в меньшей степени в эпендимоцитах и зубчатой фасции.

Результаты проведенных иммуногистохимических исследований свидетельствуют, что в пожилом и старческом возрасте статистически значимо выше количество клеток, экспрессирующих NCAM и Cdk2, что может свидетельствовать об интенсивных процессах нейро- или глиогенеза, поскольку экспрессия этих маркеров присуща этим двум видам клеток.

Известно, что нейрогенез стимулируют ишемия мозга, стресс, пребывание в «обогащенной» среде, физическая активность, а также нейродегенеративные процессы, имеются сведения, что Аβ также является сильным стимулятором нейрогенеза [16, 18]. Однако с возрастом происходят рост дифференцировки новообразованных клеток в мозге в сторону глиального фенотипа и уменьшение процента выживших клеток [18]. Таким образом, выявленное в иммуногистохимических исследованиях увеличение количества астроцитов в пожилом и старческом возрасте наряду с увеличением количества клеток, экспрессирующих NCAM и Cdk2, может служить подтверждением этого тезиса.

Кроме того, в качестве одного из важных механизмов клеточной гибели и развития нейральной патологии рассматривается индукция клеточного цикла в зрелых нейронах вследствие превалирования сигнализации, исходящей от митогенных стимулов над экспрессией факторов дифференцировки; при этом основными факторами являются комплексы специализированных белков клеточного цикла - циклины и циклинзависимые протеинкиназы [18]. В нашем исследовании, помимо экспрессии в морфологически не идентифицируемых клетках субэпендимной области и зубчатой фасции гиппокампа, экспрессия Cdk2 выявлена в пирамидных нейронах гиппокампа, что может свидетельствовать в пользу этой гипотезы. Также на сегодняшний день считается, что нарушенная реэкспрессия белков клеточного цикла запускает механизм β-ами­лоидной токсичности как основы БА [18], что подтверждается большой частотой выявления экспрессии тау-белка в группах лиц пожилого и старческого возраста.

Таким образом, при проведении иммуногистохимических исследований гиппокампа лиц разных возрастных категорий установлено, что в пожилом и старческом возрасте интенсивно протекают процессы глио- и васкулогенеза, с одной стороны, возможно, обусловленные ишемическими повреждениями головного мозга, с другой - сопровождающие развитие у пациентов патологии тау-белка, играющего большую роль в развитии БА.