Благодаря мультидисциплинарным исследованиям определена роль ряда молекулярных, клеточных, биохимических, иммунологических, реологических факторов возникновения и прогрессирования изменений артерий, характерных для атеросклероза, артериальной гипертонии, сахарного диабета (СД). Особое значение в развитии этих заболеваний принадлежит структурным компонентам сосудистой стенки, прежде всего эндотелию, а также клеткам крови [9, 14].
Существенная роль в иммунном ответе, а также в процессах, связанных с нарушением функции эндотелия, отводится факторам межклеточного взаимодействия, которые представляют собой белки, связанные с базальной мембраной. Они обеспечивают взаимодействие эндотелиоцитов и клеток крови, участвуют в реакциях связывания активированных лейкоцитов, вызывая их роллинг («прокатывание» по эндотелию) и проникновение через сосудистую стенку в окружающие ткани. Под их влиянием происходит усиление процессов клеточной адгезии, гиперагрегации клеток крови, нарушение микроциркуляции.
В этих условиях противовоспалительные цитокины (фактор некроза опухолей - TNFα, интерлейкины IL-1, IL-6, IL-8), регулируя синтез белков адгезии, обеспечивают сохранение целостности эндотелиоцитов [1, 8, 13].
Отмечается роль воспаления в развитии атеросклероза, в том числе артерий головного мозга. Воспалительный процесс при атеросклерозе имеет черты иммунного воспаления, при котором отмечается преобладание в воспалительных инфильтратах лимфоцитов и моноцитов – макрофагов, миграция которых в область накопления липидов рассматривается в качестве необходимого условия атерогенеза. Нарушение целостности и проницаемости эндотелия артерий лежит в основе образования атеросклеротических бляшек, так как ведет к проникновению во внутреннюю оболочку артерий различных компонентов плазмы крови, в первую очередь холестерина. Это стимулирует пролиферацию миоцитов, клеток соединительной ткани, вызывает утолщение внутренней оболочки артерий. Вследствие повреждения эндотелия уменьшается продукция простациклина, развивается адгезия тромбоцитов с высвобождением ими тромбоксана А2 и других веществ, способствующих формированию пристеночных тромбов.
В последние годы большое внимание уделяют роли хронического воспаления в процессе формирования и дестабилизации атеросклеротических бляшек. Полагают, что под влиянием факторов адгезии ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1 нарастает дисфункция эндотелия, что ведет к развитию воспалительного процесса в сосудистой стенке, инфильтрации ее лейкоцитами, сопровождается активацией процесса образования сосудов и повышает риск кровоизлияния в атеросклеротическую бляшку [17].
Показано, что высокая экспрессия ICAM-1 при сердечно-сосудистых заболеваниях коррелирует с факторами риска их развития – артериальной гипертонией, гиперлипидемией, курением и маркерами дисфункции эндотелия – повышением содержания С-реактивного белка, фибриногена. Высокий уровень ICAM-1 при ишемическом инсульте (ИИ) связан с большим объемом инфаркта головного мозга и тяжестью неврологического дефицита [18, 21]. Имеются данные о повышении риска развития ИИ у больных с высоким уровнем Р-селектина [7]. Обнаружено повышение Е-селектина при ИИ, обусловленном стенозом артерий головного мозга [20]. Высокая концентрация sVCAM-1 является признаком тяжелого течения ишемической болезни сердца [23]. В наших исследованиях показано, что атеросклеротический стеноз внутренней сонной артерии протекает в условиях повышенной экспрессии маркеров дисфункции эндотелия (ICAM-1, Р-селектина, PECAM-1) и активации гемостаза [5]. Получены данные о прогностической значимости маркера активации тромбоцитов - sCD40, высокая концентрация которого связана с развитием инфаркта миокарда, ИИ и наступлением летального исхода [12, 20]. Имеются данные о повышении концентрации sCD40L в крови больных СД. Гипогликемическая терапия у этих больных приводит к снижению уровня sCD40L [2]. Статины, блокируя ГМК-КоА-редуктазу, вызывают снижение экспрессии факторов адгезии (Р-селектина, VCAM-1, ICAM-1), изменяют течение иммунного воспаления при атеросклерозе и СД [12, 19, 22].
Антитела к ICAM-1 предотвращают активацию лейкоцитов и микроциркуляторные нарушения, улучшая исход ИИ. Введение мышам с СД антител к молекулам адгезии ICAM-1 и b2-интегрину не вызывает развития диабетической ретинопатии [3]. У мышей с повышенным риском развития атеросклероза при дефиците ICAM-1 и Р-селектина, вызванном введением моноклональных антител, не развивается тромбоз. Возможно, что вещества, способные блокировать факторы межклеточного взаимодействия и миграцию моноцитов в стенку артерий, имеют большое значение в разработке подходов к лечению нарушений мозгового кровообращения [6, 23].
Роль воспаления в развитии ИИ подтверждена результатами многочисленных исследований. При ИИ TNFα и интерлейкин-1β высвобождаются из нейронов, что вызывает появление Е-селектина на эндотелиоцитах, который в свою очередь способствует миграции пула лейкоцитов в область ишемии. Ранняя стадия воспаления характеризуется адгезией лейкоцитов к эндотелию, благодаря их взаимодействию с молекулами межклеточной адгезии (МКА). Лейкоциты фиксируются к эндотелию и мигрируют из крови в ткань мозга. МКА ICAM-1 и VCAM-1 облегчают взаимодействие между эндотелием и лейкоцитами в качестве первого этапа миграции лейкоцитов из крови в ткань мозга. Они взаимодействуют с β-интегринами, которые в свою очередь экспрессируются на лейкоцитах. Лейкоциты аккумулируются в капиллярах и затрудняют микроциркуляцию в области ишемии. Блокирование этого взаимодействия уменьшает не только количество лейкоцитов, но и объем ИИ.
Нарушение функции эндотелия при ИИ запускает каскад гуморальных (цитокины, факторы роста) и клеточных (адгезия, агрегация) реакций, которые ведут к прогрессированию заболевания. Каждая стадия иммунного воспаления имеет свои маркеры - МКА, цитокины с воспалительной и противовоспалительной активностью, факторы роста, маркеры системного воспаления (С-реактивный белок и фибриноген), белки системы комплемента, тромбин, белки теплового шока. Понимание важной роли иммунного воспаления при инсульте позволит разработать терапевтические стратегии профилактики прогрессирования заболевания: как усиление естественных противовоспалительных реакций, так и селективное и неселективное ингибирование развивающегося воспалительного процесса.
Цель работы - исследование содержания растворимых МКА у больных с ИИ.
Материал и методы
Обследованы 29 больных с ИИ в каротидной и вертебрально-базилярной системах в первые 48 ч от развития заболевания. Исследования содержания молекул адгезии выполнены в динамике в первые 48 ч и на 21-е сутки от начала ИИ. Определение степени тяжести неврологических нарушений проводилось по шкале инсульта Национального института здоровья США (NIHSS).
В зависимости от выраженности неврологической симптоматики выделены две группы больных. В 1-ю группу вошли 21 больной, 11 мужчин и 10 женщин, в возрасте от 42 до 75 лет с ИИ средней степени тяжести (7-16 баллов по NIHSS), из которых у 8 имелся СД 2-го типа (подгруппа 1а); подгруппу 1б составили 13 пациентов с ИИ без СД. Во 2-ю группу вошли 8 пациентов, 3 женщины и 5 мужчин, в возрасте от 43 до 82 лет с тяжелым ИИ (более 17 баллов по NIHSS). У больных 1-й группы средний балл при поступлении составил 9±4, на 21-е сутки - 3±1, у больных 2-й группы в первые 48 ч он составил 19±2, на 21-е сутки – 9±3.
Контрольную группу составили 11 здоровых.
Клинический диагноз устанавливался на основе анамнеза заболевания, исследования неврологического статуса, данных клинико-инструментальных методов исследования. По данным МРТ проводилось уточнение локализации и величины инфарктов мозга. Всем больным были проведены дуплексное сканирование магистральных артерий головы, ЭКГ, Эхо-КГ, стандартные лабораторные исследования.
В качестве иммунологических маркеров дисфункции эндотелия исследовали спектр растворимых МКА:
sICAM-1 (CD54) - МКА 1-го типа; sPECAM-1 (CD31) - молекула 1-го типа адгезии тромбоцитов к эндотелиоцитам; sР-selectin (CD62P) - тромбоцитарный селектин;
sE-selectin (CD62E) - эндотелиальный селектин;
sICAM-3 (CD50) - МКА 3-го типа; sVCAM-1 (CD106) – молекула адгезии сосудистой стенки 1-го типа.
Содержание растворимых молекул адгезии определяли методом проточной лазерной цитометрии на цитофлюориметре Beckman Coulter EPICS XL (США) с использованием тест-систем Bender-Medsystems, которые дают возможность определять в одном образце сыворотки крови одновременно несколько типов МКА.
Концентрацию МКА определяли посредством флюоресцентных микрочастиц, конъюгированных с антителами к исследуемому образцу. В качестве конъюгата использовали стрептавидин, меченный фикоэритрином. В ходе исследования первоначально по параметрам светорассеяния выделяли 2 популяции микрочастиц и анализировали каждую популяцию по интенсивности флюоресценции (рис. 1). Концентрацию исследуемого вещества вычисляли по калибровочному графику с использованием специального программного обеспечения (рис. 2).
Статистическую обработку проводили с использованием стандартного пакета прикладных программ Statistika 6.0.
Результаты и обсуждение
При анализе концентрации МКА при ИИ отмечен однонаправленный характер повышения их уровня, однако к 21-м суткам ИИ в некоторых случаях был выявлен гетерогенный характер изменений молекул адгезии (см. таблицу). Содержание sICAM-1, экспрессия которой происходит на эндотелии и антигенпредставляющих клетках, было повышено у всех больных в первые 48 ч ИИ. Так, у больных 2-й группы и подгруппы 1б ее концентрация была повышена в 2,5 и 2,3 раза соответственно (р<0,0001). К 21-м суткам ИИ содержание sICAM-1 оставалось высоким. Максимальное повышение экспрессии sICAM-1 было выявлено в подгруппе 1а. Уровень ее экспрессии в первые 48 ч ИИ превышал контрольные показатели в 3,2 раза (р<0,0001).
Содержание sPECAM-1 было увеличено во всех группах больных с ИИ, при этом в первые 48 ч во 2-й группе и подгруппе 1б содержание sPECAM-1 повысилось в 1,7 и 1,4 раза соответственно (р<0,05). В подгруппе 1а экспрессия sPECAM-1 увеличилась 1,8 раза и была максимальной (р<0,001). К 21-м суткам ИИ концентрация PECAM-1 во всех группах снизилась, но оставалась повышенной.
Экспрессия sP-селектина была повышена во всех группах больных. Так, в первые 48 ч ИИ у больных 2-й группы и подгруппы 1б его концентрация повысилась в 2,3 и 1,7 раза соответственно. К 21-м суткам заболевания содержание sP-селектина в этих группах снизилось. Максимальная его экспрессия (в 2,5 раза выше нормы) выявлена у больных подгруппы 1а (р<0,001).
Уровень экспрессии sVCAM-1, активирующей селективную адгезию лейкоцитов к стенке сосудов, был повышен у всех больных. Во 2-й группе и подгруппе 1б больных уровень ее экспрессии превышал контрольные значения в 1,6 и 1,3 раза. Наиболее высокое содержание sVCAM-1 (в 1,7 раза выше контрольных значений) наблюдалось у больных подгруппы 1а (р<0,001). К 21-м суткам ИИ ее уровень оставался высоким.
Содержание sЕ-селектина также было высоким во всех группах больных. Его концентрация во 2-й группе и подгруппе 1б пациентов превышала контрольные показатели в 3,2 и 2,9 раза соответственно (р<0,001). К 21-м суткам его концентрация снизилась, но не достигла нормы. Максимальная экспрессия Е-селектина выявлена в подгруппе 1а, показатели в которой в 3,9 раза превышали контрольные значения (р<0,001). К 21-м суткам содержание Е-селектина снизилось.
Содержание sICAM-3 во 2-й группе и подгруппе 1б больных имело лишь тенденцию к увеличению. Статистически значимое повышение концентрации sICAM-3 было отмечено лишь у больных подгруппы 1а в первые 48 ч заболевания (р<0,01). К 21-м суткам ИИ отмечалось снижение этого показателя (р<0,001).
Анализ иммунологических маркеров воспаления у больных с ИИ показал, что изменения их концентрации коррелируют с тяжестью неврологической симптоматики.
В качестве примеров приводим случаи с различным течением ИИ.
Наблюдение 1. Пациент Ч., 72 года. Диагноз: повторный инфаркт в области продолговатого мозга. Атеросклероз артерий головного мозга. Артериальная гипертензия. Постоянная форма мерцательной аритмии. СД 2-го типа. В 1-е сутки ИИ степень тяжести неврологических нарушений соответствовала 16 баллам по шкале NIHSS, на 21-е сутки - 20 баллам. Содержание sICAM-1, sPECAM-1, sР-селектина, sVCAM-1, sE-селектина было максимально высоким в 21-е сутки заболевания и превышало исходно высокие показатели в 5, 3, 7, 3, 4 раза соответственно. Состояние больного ухудшилось к 21-м суткам, он был переведен в реанимационное отделение, в последующем наступил летальный исход (рис. 3).
Наблюдение 2. Пациент Р., 70 лет. Диагноз: обширный инфаркт в левом полушарии большого мозга. При поступлении больного степень тяжести неврологических нарушений составляла 16 баллов по шкале NIHSS. К 21-м суткам состояние больного улучшилось, тяжесть неврологических нарушений составляла 5 баллов по шкале NIHSS. При этом первоначально высокие показатели экспрессии МКА снизились (рис. 4).
Обсуждение
Проведенное исследование позволило на клиническом материале изучить характер изменений маркеров иммунного воспаления у больных в остром периоде ИИ. Результаты исследования согласуются с работами, в которых обсуждается роль иммунного воспаления в развитии ИИ [7, 20, 21, 23]. Некоторые аспекты связи тяжести ИИ с содержанием МКА до сих пор остаются малоизученными. Как следует из полученных данных, повышение экспрессии sICAM-1, sPECAM-1, sР-селектина, sE-селектина, sICAM-3, sVCAM-1 у больных в остром периоде ИИ указывает на их важную роль в качестве иммунологических маркеров нарушения функции эндотелия. Выявлено, что увеличение содержания МКА в сыворотке крови больных с ИИ сочеталось с тяжелым течением инсульта и предшествовало в некоторых случаях летальному исходу, а снижение их концентрации к 21-м суткам ИИ коррелировало с положительной клинической динамикой. При ИИ средней тяжести, осложненном СД 2-го типа, установлена гиперпродукция всех исследованных МКА по сравнению с их содержанием у больных с тяжелым течением ИИ. Выявлено, что СД 2-го типа способствует активации гемостаза и может быть предиктором последующих тромботических осложнений [4, 11, 15, 16]. В настоящее время изучается влияние гипогликемической терапии на содержание МКА и улучшение регионального мозгового кровотока [10].
На основании вышеизложенного можно сформулировать следующие выводы:
1. Повышение уровня МКА (sICAM-1, sICAM-3, sPECAM-1, sР-селектин, sE-селектин, sVCAM-1) при ИИ обусловлено развитием инфаркта мозга, сопровождающимся активацией эндотелия и гемостаза.
2. Полученные результаты свидетельствуют о связи между тяжестью течения ИИ и интенсивностью экспрессии маркеров воспаления.
3. Повышенная экспрессия МКА у больных с ИИ и СД 2-го типа обусловливает особый подход к коррекции нарушений гемостаза и иммунных процессов.
4. Учитывая полученные данные, а также результаты проведенных ранее экспериментальных исследований, можно полагать, что средства, блокирующие межклеточную адгезию, имеют большое значение для разработки новых подходов к лечению больных с ИИ.