Синдром Прадера-Вилли - редкое (орфанное) генетическое заболевание, частота которого в общей популяции составляет 1:15 000-1:30 000. Заболевание характеризуется легкой или умеренно выраженной умственной отсталостью, гипогонадизмом, недостатком гормона роста (причина низкого роста), гиперфагией, ожирением, аутизмом и расстройствами личности. В раннем постнатальном периоде у пациентов отмечаются вялость и сонливость, а в более поздних - компульсии и частые смены настроения [1, 2, 7, 8, 12].

При синдроме Прадера-Вилли во время беременности у матери часто выявляется снижение активности плода, а при родах наблюдаются осложнения, вызванные его неправильным расположением. После рождения у ребенка наблюдаются неонатальная гипотония, гипоплазия клитора у девочек или уменьшенный пенис и крипторхизм у мальчиков. Эти признаки достаточны для назначения проведения молекулярно-цитогенетических исследований с целью выявления связанной с данным синдромом делеции. Среди клинических признаков синдрома в перинатальном периоде также отмечают увеличенный объем головы, долихоцефалию, миндалевидные глаза, опущенные вниз углы рта, плотную обильно стекающую слюну, уменьшенные руки и ноги. Эти черты становятся более заметными к возрасту 2-3 лет. Переедание, начинающееся в дошкольном возрасте, приводит к ожирению, которое также является одним из отличительных признаков синдрома Прадера-Вилли [1, 2, 7, 12]. Данный синдром, как и синдром Ангельмана, является болезнью геномного импринтинга. Диагностика синдрома Прадера-Вилли проводится в основном с помощью гибридизаций флюоресцентной in situ (FISH) и серийной сравнительной геномной (array CGH). Реже используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) для определения родительского происхождения хромосомы 15 или анализа метилирования последовательностей ДНК. Дифференциальная диагностика проводится с антенатальной гипотонией, синдромами Барда-Бидля и Алстрома, а также дупликациями хромосом 3p25.3-p26.2 и 10q26 [1, 4, 7, 12]. В ряде случаев гоносомной анеуплоидии (анеуплоидия с участием половых хромосом) могут наблюдаться некоторые фенотипические признаки синдрома Прадера-Вилли (в частности, при кариотипе 47,XXY, связанном с синдромом Клайнфелтера) [1, 11].

Синдром Ангельмана - редкое генетическое заболевание, частота которого варьирует от 1:10 000 до 1:20 000 в общей популяции. Основные клинические проявления синдрома включают в себя тяжелую умственную отсталость, отсутствие речи, микроцефалию, макростомию, прогнатию, эпилептиформные проявления и характерные микроаномалии развития. Данное заболевание характеризуется также гиперактивностью и нарушениями сна, постоянно поднятым настроением с периодами внезапного немотивированного смеха. В течение 1-го полугода жизни могут отмечаться мышечная гипотония и проблемы с кормлением (отказ от пищи; частые рефлюксы). После 1-го года жизни появляется такой характерный фенотипический признак синдрома, как взрывы немотивированного смеха; отсутствие речи и умственная отсталость становятся более выраженными. Для детей с синдромом Ангельмана характерны также эпилептиформные проявления. Часто отмечается наличие трехфазной δ-актив­ности на ЭЭГ с наибольшей выраженностью в лобной области. Пациентам с этим синдромом свойственны гастроэзофагеальный рефлюкс, судороги, нарушения зрения и повышенное выделение слюны. Дифференциальная диагностика проводится со случаями спастической параплегии, возникшей из-за родовых травм, а также гипсаритмией, синдромами Веста и Моуат-Вильсона. Диагноз «синдром Ангельмана» подтверждается с помощью молекулярно-цитогенетических (FISH и array CGH) или молекулярно-генетических методов [1, 2, 5-10, 12, 14].

Синдромы Ангельмана и Прадера-Вилли связаны как с эпигенетическими, так и генетическими нарушениями в проксимальной области длинного плеча хромосомы 15. Синдром Прадера-Вилли связан в основном с делецией хромосомы 15 отцовского происхождения в участке 15q11.2-q13 (примерно в 70% случаев), унипарентальной дисомией (обе гомологичные хромосомы 15 материнского происхождения в 20-30% случаев) или дефектами импринтинга (аномальное метилирование последовательностей ДНК в участке 15q11.2 в 2-5% случаев). Как правило, синдром Ангельмана является результатом делеции хромосомы 15 материнского происхождения в участке 15q11.2-q13 (в 60-75% случаев), унипарентальной дисомии (обе гомологичные хромосомы 15 отцовского происхождения в 2-5% случаев), дефекта импринтинга (аномальное метилирование последовательностей ДНК в участке 15q11.2 в 2-5% случаев) или мутации в гене UBE3A (в 10%) [1, 8, 12, 14].

Несмотря на то что различные аспекты клинической и молекулярной диагностики синдромов Ангельмана и Прадера-Вилли в современной литературе описаны крайне подробно, в педиатрической и медико-генетической практике могут возникать сложности при постановке диагноза, приводящие к ошибкам в клинической и лабораторной диагностике.

Цель настоящей работы - рассмотрение особенностей генетической диагностики синдромов Ангельмана и Прадера-Вилли на примере 30 наблюдений, в том числе 2 атипичных случаев.

Все больные были направлены в лаборатории Научного центра психического здоровья РАМН и Московского НИИ педиатрии и детской хирургии для подтверждения диагноза.

Предварительный генетический анализ больных детей был проведен с применением различных цитогенетических и молекулярно-цитогенетических диагностических тестов на наиболее частые генные и хромосомные синдромы, ассоциированные с аутистическими расстройствами и синдромальными формами умственной отсталости, включая FISH для анализа случаев хромосомного мозаицизма и субтеломерных микроделеций и дупликаций [1, 4, 13, 15-22]. Молекулярное кариотипирование в этой когорте детей было описано нами ранее [5, 6, 10]. В данной работе проведены цитогеномные исследования 30 детей с предполагаемым диагнозом синдромов Ангельмана или Прадера-Вилли.

In silico или биоинформатический анализ выявленных вариаций генома (CNV) проводили с использованием следующих баз данных: DECIPHER (database of unbalanced chromosome aberrations) - decipher.sanger.ac.uk, OMIM (online Mendelian inheritance in Man) - www.omim.org, The Phenotype-Genotype Integrator (PheGenI) - www.ncbi.nlm.nih.gov/gap/PheGenI, SFARI Gene/AutDB (web-based searchable database for autism research) - www.mindspec.org/autdb.html, Catalog of Published Genome-Wide Association Studies (NHGRI) www.genome.gov/gwastudies.

У 4 пациентов из 30 делеции в участке 15q11.2-q13 были выявлены цитогенетическим методом. Методом FISH были обследованы 8 пациентов, у 5 из них делеция была подтверждена. Часть пациентов обследовали с использованием нашей модификации технологии высокоразрешающей сравнительной геномной гибридизации (CGH) и array CGH. Этими методами были выявлены случаи делеции в участке 15q11.2-q13 у 5 пациентов.

Ниже более подробно описываются 2 необычных случая с клиническим диагнозом «синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана», лабораторная диагностика которых потребовала сочетанного применения различных молекулярно-цитогенетических методов.

Мальчик родился от молодых здоровых родителей. На 37-й неделе беременности у матери было обнаружено снижение активности плода, в связи с этим проведены экстренные роды с помощью кесарева сечения. При рождении масса тела ребенка была 2300 г, длина - 43 см, оценка по шкале Апгар - 3/8 баллов. В раннем неонатальном периоде наблюдались выраженная гипотония и крипторхизм, а также отставание в физическом и психомоторном развитии. Когда ребенку исполнилось 6 мес, на основе клинических проявлений было рекомендовано проведение прометафазного цитогенетического исследования хромосомного участка 15q11.2 для определения возможных хромосомных аномалий, связанных с синдромом Прадера-Вилли. Молекулярно-цитогенетическую диагностику проводили с использованием метода FISH и проб на критический участок синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана, а также прицентромерный участок хромосомы 15 согласно ранее описанному протоколу [1-3, 10, 12-14]. В ходе цитогенетического и молекулярно-цитогенетического исследования затрагивающих участок 15q11.2 хромосомных микроаномалий обнаружено не было (рис. 1, см. на цв. вклейке).

Клинические проявления синдрома Прадера-Вилли ранее были описаны у детей с дополнительной хромосомой Х в мужском кариотипе, которым после цитогенетической диагностики ставился диагноз «синдром Клайнфелтера» [6]. Описаны также случаи сочетанного фенотипа синдрома Прадера-Вилли и других генетических заболеваний (синдром умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, болезнь Дауна), являвшихся результатом сочетания двух, по-видимому, несвязанных хромосомных аномалий у одного ребенка [1, 7, 8, 11]. Однако случаев кариотипа 49,XXXXY у детей с клиническими признаками синдрома Прадера-Вилли до настоящего времени описано не было. Важно, что во многих отечественных лабораториях диагностика синдромов, связанных с аномальным импринтингом в участке хромосомы 15q11.2, проводится с использованием исключительно молекулярно-генетических методов. Тем не менее настоящий случай показывает ограничения подобного подхода к диагностике синдрома Прадера-Вилли, поскольку без использования цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов она сводится к констатации факта отсутствия мутации без постановки диагноза. Вследствие этого подобные случаи классифицируются как недифференцированные, что в значительной степени снижает эффективность оказания адекватной медицинской помощи таким детям.

Мальчик родился от второй беременности, протекавшей на фоне токсикоза в I триместре и острого гестоза во II триместре, с помощью кесарева сечения на 38-й неделе с массой тела 3250 г и длиной 52 см, оценкой по шкале Апгар 6/8 баллов. На 1-м году жизни у ребенка выявилась выраженная задержка моторного развития. При осмотре в возрасте 4 лет были отмечены задержка речевого развития, гиперактивность, атаксия, нарушения мелкой моторики, низкий мышечный тонус, гипоплазия мечевидного отростка, уплощенный затылок, макрогения, редкие зубы с нарушением формы. Учитывая клинические проявления, было рекомендовано проведение цитогенетического анализа и молекулярно-генетического исследования мутаций, связанных с синдромами Ангельмана и Прадера-Вилли. Молекулярную и цитогенетическую диагностику проводили по месту жительства (Амурская область). Хромосомных аномалий, делеций или унипарентальной дисо­мии хромосомы 15 обнаружено не было. При использовании метода FISH с ДНК-пробой на критический участок синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана хромосомных аберраций в участке 15q11.2 также не было выявлено. В связи с этим было рекомендовано полногеномное сканирование несбалансированных хромосомных микроперестроек с помощью array CGH.

При проведении высокоразрешающей array CGH (молекулярное кариотипирование) [10] с использованием SNP (single-nucleotide polymorphism - однонуклеотидные полиморфные изменения последовательности ДНК)-платформы, позволяющей определять как несбалансированные геномные вариации (разрешение примерно 1 тыс. пн и менее), так и потерю гетерозиготности или унипарентальную дисомию, были выявлены делеции в участках Yq11.23 и 7q21.11, а также дупликация Xq28. С помощью оригинального биоинформатического метода [10] было показано, что эти изменения генома являются факторами риска развития бесплодия, психических заболеваний (аутизм и шизофрения). Помимо указанных выше вариаций генома, также была обнаружена сегментная унипарентальная дисомия хромосомы 15 участка размером примерно 1 млн пн (рис. 3, см. на цв. вклейке).

Унипарентальная дисомия, затрагивающая все последовательности ДНК хромосомы 15, является одной из частых причин болезней импринтинга, в частности с синдромами Ангельмана и Прадера-Вилли [1, 7, 8, 14]. Однако эпигенетические мутации в виде сегментной унипарентальной дисомии геномных участков небольших размеров встречаются крайне редко [12, 14]. Вероятно, это связано с тем, что технологии, позволяющие определять эпигенетические изменения в виде потери гетерозиготности небольших последовательностей ДНК (олигонуклеотидная/SNP array CGH), сравнительно недавно стали использоваться для молекулярной диагностики геномных болезней [7, 8, 13]. Учитывая, что ни один из наиболее часто применяемых методов диагностики синдрома Ангельмана не позволил подтвердить клинический диагноз, можно с уверенностью утверждать, что использование высокоразрешающей олигонуклеотидной/SNP array CGH может рассматриваться как наиболее эффективная технология определения геномных субмикроскопических и эпигенетических аномалий. Тем не менее данная технология позволяет выявлять нарушения или вариации генома, приводящие к умственной отсталости, врожденным порокам развития, аутизму, эпилепсии, только при использовании соответствующих биоинформатических технологий. В противном случае даже ее высокая эффективность не позволяет врачу-генетику правильно интерпретировать результаты полногеномного анализа. Таким образом, лабораторная диагностика геномных перестроек, затрагивающих последовательности ДНК менее 1-2 млн пн, или эпигенетических мутаций (сегментные потери гетерозиготности или унипарентальная дисомия), затрагивающих последовательности ДНК менее 10 млн пн, требуют использования высокоэффективных методов биоинформатического анализа для корректной интерпретации [9].

Описанные в настоящей работе случаи демонстрируют необходимость использования как высокоразрешающих постгеномных технологий (олигонуклеотидная/SNP array CGH), так и классических цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов в диагностической практике. Однако, несмотря на относительную определенность критериев синдромов Ангельмана и Прадера-Вилли, диагностика генетических и эпигенетических мутаций в участке хромосомы 15q11.2 при этих заболеваниях может вызывать ряд затруднений. Как наглядно видно из приведенных выше примеров (первый случай), клинический диагноз может быть ошибочным из-за того, что подобными фенотипическими признаками также обладают и другие редкие генетические заболевания (например, редкие хромосомные синдромы). В этих случаях диагностика подобных аномалий хромосом может быть эффективной даже при использовании классических цитогенетических методов. Однако дополнительное привлечение молекулярно-цитогенетических технологий (например, FISH) также бывает необходимо для подтверждения диагноза. Более того, как видно из описания второго случая, даже несколько методов диагностики мутаций в участке хромосомы 15q11.2 могут давать ложнонегативные результаты. Решение подобных проблем возможно только с использованием технологии высокоразрешающей array CGH (молекулярное кариотипирование) на олигонуклеотидной/SNP-платформе, позволяющей определять вариации генома и потерю гетерозиготности, а также биоинформатического анализа для корректной интерпретации обнаруженных изменений последовательностей ДНК. Таким образом, можно сделать вывод, что хотя цитогенетическая диагностика была разработана более 50 лет назад, она позволяет избегать ошибок при диагностике заболеваний, клинически похожих на синдром Прадера-Вилли. Обоснован также вывод, что новейшие молекулярно-цитогенетические и постгеномные технологии необходимы для исключения ошибок при проведении диагностики другими молекулярно-генетическими методами. Особенно актуально применение молекулярного кариотипирования при лабораторной диагностике недифференцированных форм нервных и психических заболеваний у детей, когда причиной болезни могут являться ранее не описанные генные, хромосомные или геномные мутации.

Работа частично поддержана грантом Президента Российской Федерации (МД-4401.2013.7).