Известно, что умственная отсталость, аутизм, эпилепсия относятся к наиболее распространенным заболеваниям ЦНС, суммарная частота которых составляет от 1:80 до 1:150 человек общего населения [1, 2, 6, 8-10]. Известно, что умственная отсталость различного генеза встречается в когорте детей с нарушениями психики с частотой до 2,5-3%, а аутизм - 0,5-1%. У многих детей этой группы имеются сочетанные расстройства. Например, у 70% детей с заболеваниями аутистического спектра наблюдается умственная отсталость, а у 10% - эпилепсия [8]. Этим детям показана генетическая диагностика с последующей коррекцией психологических и поведенческих нарушений. Большинство больных с аутизмом, ассоциированным с умственной отсталостью, нуждаются в социальной и образовательной поддержке в течение всей жизни [1, 2, 5, 8].

Этиология расстройств аутистического спектра и умственной отсталости во многих случаях сложна и не определяется единой причиной, поэтому выявление множества генов и генных сетей, которые могут оказывать влияние на возникновение таких расстройств, значимо для лучшего понимания лежащих в основе поведенческих и когнитивных нарушений нейробиологических механизмов [5, 29]. Расстройства аутистического спектра, сопряженные с умственной отсталостью или задержкой психического развития, являются частой причиной обращения к генетической диагностике [13]. Генетические и геномные нарушения выявляются с высокой частотой у детей с расстройствами аутистического спектра и умственной отсталостью [9, 10, 13, 19]. При этих расстройствах встречаются как видимые под микроскопом хромосомные аномалии, так и субмикроскопические вариации числа копий ДНК и моногенные мутации. Идентификация генов, влияющих на возникновение заболевания, позволяет выявить лежащий в его основе механизм нарушения развития. Определение функции гена может помочь в анализе нарушений развития и функционирования мозга. Однако один и тот же ген может оказывать влияние на множество процессов, происходящих в различных частях мозга. Таким образом, с точностью определить нарушение, приводящее к конкретному расстройству, можно, только выявив сеть генов, связанных между собой и влияющих друг на друга. В настоящее время молекулярно-цитогенетическая диагностика стала неотъемлемой частью медицинской генетики - медико-генетического консультирования для оказания высокотехнологичной медицинской помощи детям, страдающим умственной отсталостью, аутизмом, эпилепсией, врожденными пороками и микроаномалиями развития, позволяющей выявлять различные генные и хромосомные нарушения [1, 12]. Это стало возможным при использовании современных молекулярно-цитогенетических и постгеномных технологий, среди которых молекулярное кариотипирование с использованием ДНК-микрочипов (array CGH) считается наиболее современным методом выявления геномных и хромосомных аномалий у детей с умственной отсталостью и аутизмом [9-12, 19-22].

В первых работах авторов, проведенных в России по поиску геномных и хромосомных аберраций у детей с умственной отсталостью и аутизмом, была применена технология серийной сравнительной геномной гибридизации на ДНК-микроматрицах в сочетании с молекулярно-цитогенетическими методами (FISH) и высокоразрешающей сравнительной геномной гибридизацией на хромосомных препаратах in situ (HRCGH) [5-7, 16, 17]. Эти постгеномные технологии были специально разработаны для проведения анализа микроаномалий и вариаций ДНК, которые невозможно выявить с помощью цитогенетических методов анализа хромосом. Микроаномалии генома или вариации числа копий (copy number variations - CNV) представляют собой делеции или дупликации какого-либо участка геномной ДНК и могут включать один или множество генов. Размер их варьирует от нескольких тысяч до миллиона пар нуклеотидов. Подобные изменения в некоторых регионах генома с некодирующей ДНК могут быть доброкачественными и не проявляться фенотипически, однако многие типы вариаций числа копий, являющиеся, по-видимому, причинными факторами умственной отсталости и аутизма, чаще всего не обнаруживаются в контрольных группах [1, 6]. Предполагается, что большая часть генов, ассоциированных с психическими и когнитивными расстройствами, скорее оказывает влияние на предрасположенность к заболеванию, чем является его непосредственной и единственной причиной; каждый отдельный ген может играть относительно небольшую роль. Возможность связать вместе совокупность действия генов при патологии ЦНС и в норме зависит от знания их функций. Большое значение в этих исследованиях имеет биоинформативный анализ большого объема данных относительно особенностей CNV, накопленных к настоящему времени в различных лабораториях мира.

В настоящее время эта область геномики и биоинформатики активно развивается [3, 16, 17].

Использование новейших методов сканирования генома, основанных на сравнительной геномной гибридизации, позволяет с наибольшей эффективностью определять точки разрыва при хромосомных аномалиях и выявлять микроперестройки хромосом. Среди этих технологий особо выделяют array CGH. Эта технология позволяет обнаружить различные геномные заболевания и повышает эффективность молекулярной диагностики генетических аномалий в группах детей с пороками развития, умственной отсталостью и аутизмом [1, 3, 5].

Цель данной работы - исследование нарушений генома у детей с аутистическими расстройствами и идиопатической умственной отсталостью с помощью высокоразрешающей сравнительной геномной гибридизации на метафазных хромосомах in situ и молекулярного кариотипирования на ДНК-микрочипах.

Провели цитогеномные исследования 150 детей (124 мальчика и 26 девочек) с недифференцированными формами аутизма, ассоциированными с умственной отсталостью. У 100 из этих детей умственная отсталость имела место при наличии врожденных пороков развитя.

Кроме того, были обследованы 54 ребенка (31 мальчик и 23 девочки) с идиопатической умственной отсталостью и врожденными пороками развития без расстройств аутистического спектра.

Эти когорты больных детей были отобраны в ходе проведения комплексного клинико-психологического, цитогенетического и молекулярно-цитогенетического исследования более чем 1000 детей с идиопатическим аутизмом и умственной отсталостью.

Предварительный генетический анализ был проведен с применением различных диагностических тестов на наиболее частые генные и хромосомные синдромы, ассоциированные с аутистическими расстройствами и синдромальными формами умственной отсталости, включая анализ FISH случаев хромосомного мозаицизма и субтеломерных микроделеций и дупликаций [1, 7, 13-15, 23-30]. Биоинформатический анализ выявленных CNV проводили с использованием следующих баз данных: DECIPHER (Database of Unbalanced Chromosome Aberrations) - http://decipher.sanger.ac.uk/, OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) - http://www.omim.org/, The Phenotype-Genotype Integrator (PheGenI) - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap/PheGenI, SFARI Gene/AutDB (web-based searchable database for autism research) - http://www.mindspec.org/autdb.html, Catalog of Published Genome-Wide Association Studies (NHGRI) http://www.genome.gov/gwastudies/.

При обследовании 100 детей с умственной отсталостью и врожденными пороками развития методом HRCGH на хромосомных препаратах in situ в 46% случаев были выявлены микроперестройки генома. Пример применения метода HRCGH представлен на рис. 1 на цв. вклейке.

Мы оценили также частоту и сложность геномных вариаций, обследовав этим методом 50 детей с аутизмом и умственной отсталостью без пороков развития. В 44 (88%) случаях из 50 были выявлены различные геномные аномалии и CNV. В 23 (52%) случаях из 44 имелись несбалансированные геномные перестройки. Они включали делеции, дупликации, субтеломерные перестройки, а также сочетанные геномные нарушения. Большие терминальные делеции (размер 4,7-6,1 млн пар нуклеотидов) обнаружены в 4 случаях (del4pter/dup8pter; del7qter; del10qter; dup19pter). 3 случая были связаны с дупликацией (1 мальчик) и делецией (2 девочки) участка Xq28 (включая гены, контролирующие экспрессию генов в нейронах мозга). В 1 случае выявлена небольшая делеция участка 2qter (<1 млн пар нуклеотидов). Остальные нарушения представляли собой более сложные перестройки в виде множественных мелких делеций и дупликаций (<0,3 млн пар нуклеотидов), расположенных на большом расстоянии от теломер. Среди них в 2 случаях наблюдалось рекуррентное совпадение делеций в 9qter и 21qter. В 4 случаях обнаружены следующие CNV размером от 0,1 до 0,3 млн пар нуклеотидов: del1pter/del5pter; del4qter/del5qter; dup16pter/del6pter; del1pter/del4pter/del20qter. Наконец, в 1 случае выявилась конституциональная геномная нестабильность, проявляющаяся в виде множественных делеций и дупликаций (размер от 1 до 2,5 млн пар нуклеотидов), включающих несколько субтеломерных регионов (1pter; 16pter; 20qter; 22qter). Эти данные позволяют предположить, что небольшие (<1 млн пар нуклеотидов) комплексные СNV часто встречаются у детей с умственной отсталостью и расстройствами аутистического спектра.

При обследовании указанной выше группы из 54 детей с идиопатической умственной отсталостью и врожденными пороками развития без расстройств аутистического спектра с использованием молекулярного кариотипирования и ДНК-микроматриц, содержащих увеличенное число ДНК-проб на геномные локусы хромосомы Х были выявлены делеции и дупликации различных участков хромосомы Х у 11 (20,4%) детей. Из них 5 (9,3%) были мальчики с несиндромальной Х-сцепленной умственной отсталостью, 4 (7,4%) - девочки с атипичной формой синдрома Ретта, 1 (1,9%) - девочка с несиндромальной Х-сцепленной умственной отсталостью и 1 (1,9%) - девочка с Х-сцепленной формой аутизма. При применении ДНК-микрочипов высокого разрешения (Affimetrics Cytoscan HD, содержащие 2 696 550 олигонуклеотидных проб) было обнаружено, что атипичная форма синдрома Ретта связана с делециями гена МЕСР2 и других, расположенных в участке Хq28 (IRAK1, OPN1LW, TEX28, TKTL1, FLNA, TAZ, ATP6AP1, SLC10A3, IKBKG). Несиндромальная Х-сцепленная умственная отсталость у мальчиков была связана с делециями генов AR (Xq12) и RAB39B (Xq28), а также дупликациями генов ZNF182 (Xp11.23), EDA (Xq13.1) и МЕСР2 (Xq28). У девочки она была ассоциирована с делецией гена UPF3B (Xq24), который, как показано ранее, связан с умственной отсталостью и микроаномалиями развития как мальчиков, так и девочек, несмотря на феномен Х-инактивации (причины асимптоматического носительства Х-сцепленных мутаций у девочек). Х-сцепленная форма аутизма у девочки была ассоциирована с делецией гена нейролигина NLGN4X (Xp22.31), вариации последовательностей ДНК которого рассматриваются в качестве одного из наиболее частых генетических дефектов в генах хромосомы Х при аутистических расстройствах (классический аутизм и синдром Аспергера). Полученные данные подтверждают выдвинутые нами ранее предположения о значительном вкладе Х-сцепленных мутаций (включая CNV) в этиологию умственной отсталости, а также демонстрируют высокую эффективность молекулярного кариотипирования с использованием ДНК-микрочипов, содержащих увеличенное число ДНК-проб на геномные локусы хромосомы Х, при диагностике Х-сцепленной умственной отсталости.

Таким образом, использование новейших методов сканирования генома, основанных на сравнительной геномной гибридизации на ДНК-микрочипах, позволяет с наибольшей эффективностью определять точки разрыва при хромосомных аномалиях и выявлять микроперестройки хромосом.

Array CGH в десятки раз (с 4-5 до 40-50%) повышает эффективность молекулярной диагностики генетических аномалий в группах детей с аутизмом, пороками развития и умственной отсталостью и позволяет также обнаружить новые геномные заболевания [1, 4-6]. При умственной отсталости с аутистическими расстройствами (наиболее частые формы нарушения психики у детей) применение FISH позволило показать, что от 20 до 40% случаев связаны с нарушениями генома, проявляющимися на хромосомном (микроскопический и субмикроскопический) уровне [2, 5]. Выявленные в работе вариации числа копий представляют собой делеции или дупликации какого-либо участка ДНК. Как было отмечено, размер их варьирует от нескольких тысяч до миллионов пар нуклеотидов, и они могут включать от одного до нескольких десятков генов. Подобные вариации генома могут не проявляться фенотипически. Однако CNV, являющиеся, по-видимому, причинными факторами аутизма, чаще всего не обнаруживаются в контрольных группах [4, 5, 14, 18, 29].

Исследования геномных и хромосомных нарушений у детей с аутистическими расстройствами и умственной отсталостью значимы не только для дифференциальной генетической диагностики, но и определения патогенетических механизмов идиопатических форм этих тяжелых социально значимых заболеваний, а также разработки научно обоснованных методов медицинской и психологической коррекции нарушений психики. Проведенное исследование детей с идиопатическим аутизмом и умственной отсталостью является одним из первых в России.

Работа была поддержана грантами DLR/BMBF RUS 11/002, РФФИ №12-04-00215 и Президента России МД-4401.2013.7.