Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Ворсанова С.Г.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва;
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва;
Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Юров И.Ю.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва;
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва;
Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Куринная О.С.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва;
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва;
Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Воинова В.Ю.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва;
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва;
Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Юров Ю.Б.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва;
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва;
Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Геномные аномалии у детей с умственной отсталостью и аутизмом: использование технологии сравнительной геномной гибридизации на хромосомах in situ (HRCGH) и молекулярного кариотипирования на ДНК-микроматрицах (array CGH)

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(8): 46‑49

Просмотров : 1029

Загрузок : 31

Как цитировать

Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Куринная О.С., Воинова В.Ю., Юров Ю.Б. Геномные аномалии у детей с умственной отсталостью и аутизмом: использование технологии сравнительной геномной гибридизации на хромосомах in situ (HRCGH) и молекулярного кариотипирования на ДНК-микроматрицах (array CGH). Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(8):46‑49.
Vorsanova SG, Iurov IIu, Kurinnaia OS, Voinova VIu, Iurov IuB. Genomic abnormalities in children with mental retardation and autism: the use of comparative genomic hybridization in situ (HRCGH) and molecular karyotyping with DNA-microchips (array CGH). Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2013;113(8):46‑49. (In Russ.).

Авторы:

Ворсанова С.Г.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва;
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва;
Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Все авторы (5)

Известно, что умственная отсталость, аутизм, эпилепсия относятся к наиболее распространенным заболеваниям ЦНС, суммарная частота которых составляет от 1:80 до 1:150 человек общего населения [1, 2, 6, 8-10]. Известно, что умственная отсталость различного генеза встречается в когорте детей с нарушениями психики с частотой до 2,5-3%, а аутизм - 0,5-1%. У многих детей этой группы имеются сочетанные расстройства. Например, у 70% детей с заболеваниями аутистического спектра наблюдается умственная отсталость, а у 10% - эпилепсия [8]. Этим детям показана генетическая диагностика с последующей коррекцией психологических и поведенческих нарушений. Большинство больных с аутизмом, ассоциированным с умственной отсталостью, нуждаются в социальной и образовательной поддержке в течение всей жизни [1, 2, 5, 8].

Этиология расстройств аутистического спектра и умственной отсталости во многих случаях сложна и не определяется единой причиной, поэтому выявление множества генов и генных сетей, которые могут оказывать влияние на возникновение таких расстройств, значимо для лучшего понимания лежащих в основе поведенческих и когнитивных нарушений нейробиологических механизмов [5, 29]. Расстройства аутистического спектра, сопряженные с умственной отсталостью или задержкой психического развития, являются частой причиной обращения к генетической диагностике [13]. Генетические и геномные нарушения выявляются с высокой частотой у детей с расстройствами аутистического спектра и умственной отсталостью [9, 10, 13, 19]. При этих расстройствах встречаются как видимые под микроскопом хромосомные аномалии, так и субмикроскопические вариации числа копий ДНК и моногенные мутации. Идентификация генов, влияющих на возникновение заболевания, позволяет выявить лежащий в его основе механизм нарушения развития. Определение функции гена может помочь в анализе нарушений развития и функционирования мозга. Однако один и тот же ген может оказывать влияние на множество процессов, происходящих в различных частях мозга. Таким образом, с точностью определить нарушение, приводящее к конкретному расстройству, можно, только выявив сеть генов, связанных между собой и влияющих друг на друга. В настоящее время молекулярно-цитогенетическая диагностика стала неотъемлемой частью медицинской генетики - медико-генетического консультирования для оказания высокотехнологичной медицинской помощи детям, страдающим умственной отсталостью, аутизмом, эпилепсией, врожденными пороками и микроаномалиями развития, позволяющей выявлять различные генные и хромосомные нарушения [1, 12]. Это стало возможным при использовании современных молекулярно-цитогенетических и постгеномных технологий, среди которых молекулярное кариотипирование с использованием ДНК-микрочипов (array CGH) считается наиболее современным методом выявления геномных и хромосомных аномалий у детей с умственной отсталостью и аутизмом [9-12, 19-22].

В первых работах авторов, проведенных в России по поиску геномных и хромосомных аберраций у детей с умственной отсталостью и аутизмом, была применена технология серийной сравнительной геномной гибридизации на ДНК-микроматрицах в сочетании с молекулярно-цитогенетическими методами (FISH) и высокоразрешающей сравнительной геномной гибридизацией на хромосомных препаратах in situ (HRCGH) [5-7, 16, 17]. Эти постгеномные технологии были специально разработаны для проведения анализа микроаномалий и вариаций ДНК, которые невозможно выявить с помощью цитогенетических методов анализа хромосом. Микроаномалии генома или вариации числа копий (copy number variations - CNV) представляют собой делеции или дупликации какого-либо участка геномной ДНК и могут включать один или множество генов. Размер их варьирует от нескольких тысяч до миллиона пар нуклеотидов. Подобные изменения в некоторых регионах генома с некодирующей ДНК могут быть доброкачественными и не проявляться фенотипически, однако многие типы вариаций числа копий, являющиеся, по-видимому, причинными факторами умственной отсталости и аутизма, чаще всего не обнаруживаются в контрольных группах [1, 6]. Предполагается, что большая часть генов, ассоциированных с психическими и когнитивными расстройствами, скорее оказывает влияние на предрасположенность к заболеванию, чем является его непосредственной и единственной причиной; каждый отдельный ген может играть относительно небольшую роль. Возможность связать вместе совокупность действия генов при патологии ЦНС и в норме зависит от знания их функций. Большое значение в этих исследованиях имеет биоинформативный анализ большого объема данных относительно особенностей CNV, накопленных к настоящему времени в различных лабораториях мира.

В настоящее время эта область геномики и биоинформатики активно развивается [3, 16, 17].

Использование новейших методов сканирования генома, основанных на сравнительной геномной гибридизации, позволяет с наибольшей эффективностью определять точки разрыва при хромосомных аномалиях и выявлять микроперестройки хромосом. Среди этих технологий особо выделяют array CGH. Эта технология позволяет обнаружить различные геномные заболевания и повышает эффективность молекулярной диагностики генетических аномалий в группах детей с пороками развития, умственной отсталостью и аутизмом [1, 3, 5].

Цель данной работы - исследование нарушений генома у детей с аутистическими расстройствами и идиопатической умственной отсталостью с помощью высокоразрешающей сравнительной геномной гибридизации на метафазных хромосомах in situ и молекулярного кариотипирования на ДНК-микрочипах.

Материал и методы

Провели цитогеномные исследования 150 детей (124 мальчика и 26 девочек) с недифференцированными формами аутизма, ассоциированными с умственной отсталостью. У 100 из этих детей умственная отсталость имела место при наличии врожденных пороков развитя.

Кроме того, были обследованы 54 ребенка (31 мальчик и 23 девочки) с идиопатической умственной отсталостью и врожденными пороками развития без расстройств аутистического спектра.

Эти когорты больных детей были отобраны в ходе проведения комплексного клинико-психологического, цитогенетического и молекулярно-цитогенетического исследования более чем 1000 детей с идиопатическим аутизмом и умственной отсталостью.

Предварительный генетический анализ был проведен с применением различных диагностических тестов на наиболее частые генные и хромосомные синдромы, ассоциированные с аутистическими расстройствами и синдромальными формами умственной отсталости, включая анализ FISH случаев хромосомного мозаицизма и субтеломерных микроделеций и дупликаций [1, 7, 13-15, 23-30]. Биоинформатический анализ выявленных CNV проводили с использованием следующих баз данных: DECIPHER (Database of Unbalanced Chromosome Aberrations) - http://decipher.sanger.ac.uk/, OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) - http://www.omim.org/, The Phenotype-Genotype Integrator (PheGenI) - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap/PheGenI, SFARI Gene/AutDB (web-based searchable database for autism research) - http://www.mindspec.org/autdb.html, Catalog of Published Genome-Wide Association Studies (NHGRI) http://www.genome.gov/gwastudies/.

Результаты и обсуждение

При обследовании 100 детей с умственной отсталостью и врожденными пороками развития методом HRCGH на хромосомных препаратах in situ в 46% случаев были выявлены микроперестройки генома. Пример применения метода HRCGH представлен на рис. 1 на цв. вклейке.

Рисунок 1. Результаты array CGH. а - сочетанная хромосомная аномалия - дупликация (удвоение последовательностей ДНК) хромосомы 3 [dup(3)(q29qter)] и делеция (потеря последовательностей ДНК) хромосомы 22 [del(22)(q13.33qter)]; б - делеция хромосомы 6 [del(6)(p25.1p24.1)]; в - делеция хромосомы 15 [del(15)(q13.1q13.3)].
Выявленные микроаномалии генома включали 29 (63%) случаев интерстициальных делеций, 7 (15%) - дупликаций, 7 (15%) - субтеломерных перестроек, 3 (7%) - сочетанных нарушений, предположительно связанных с субтеломерными перестройками. Использование метода array CGH показало, что картина генетических нарушений у больных с недифференцированными формами аутизма и умственной отсталости может быть более сложной, чем казалось ранее. Пример применения метода array CGH представлен на рис. 2 на цв. вклейке.
Рисунок 2. Примеры исследования хромосомных перестроек с помощью серийной CGH. а - анализ случая кольцевой хромосомы 11: делеция 11q24.1->11qter от 121411392-го нуклеотида хромосомы 11 до терминального (теломерный) участка - примерно 13,5 млн пар нуклеотидов (пн); б - анализ случая сочетанной хромосомной аномалии: делеция 1p36.32->1р36.22, составляющая примерно 4,44 млн пн, от 4932799-го до 9373344-го нуклеотида хромосомы 1 (изображен анализ только короткого плеча хромосомы 1 - 179 проб), и увеличение на 20-30% количества ДНК всего короткого плеча хромосомы 12 (примерно 33,5 млн пн); в - анализ случая несбалансированной транслокации t(X;3): субтеломерная дупликация 3рter->3p22.3, составляющая примерно 36,5 млн пн, до 36550871-го нуклеотида хромосомы 3 и делеция Xpter->Xp22.33, составляющая примерно 9,7 млн пн, до 9726574-го нуклеотида хромосомы Х.

Мы оценили также частоту и сложность геномных вариаций, обследовав этим методом 50 детей с аутизмом и умственной отсталостью без пороков развития. В 44 (88%) случаях из 50 были выявлены различные геномные аномалии и CNV. В 23 (52%) случаях из 44 имелись несбалансированные геномные перестройки. Они включали делеции, дупликации, субтеломерные перестройки, а также сочетанные геномные нарушения. Большие терминальные делеции (размер 4,7-6,1 млн пар нуклеотидов) обнаружены в 4 случаях (del4pter/dup8pter; del7qter; del10qter; dup19pter). 3 случая были связаны с дупликацией (1 мальчик) и делецией (2 девочки) участка Xq28 (включая гены, контролирующие экспрессию генов в нейронах мозга). В 1 случае выявлена небольшая делеция участка 2qter (<1 млн пар нуклеотидов). Остальные нарушения представляли собой более сложные перестройки в виде множественных мелких делеций и дупликаций (<0,3 млн пар нуклеотидов), расположенных на большом расстоянии от теломер. Среди них в 2 случаях наблюдалось рекуррентное совпадение делеций в 9qter и 21qter. В 4 случаях обнаружены следующие CNV размером от 0,1 до 0,3 млн пар нуклеотидов: del1pter/del5pter; del4qter/del5qter; dup16pter/del6pter; del1pter/del4pter/del20qter. Наконец, в 1 случае выявилась конституциональная геномная нестабильность, проявляющаяся в виде множественных делеций и дупликаций (размер от 1 до 2,5 млн пар нуклеотидов), включающих несколько субтеломерных регионов (1pter; 16pter; 20qter; 22qter). Эти данные позволяют предположить, что небольшие (<1 млн пар нуклеотидов) комплексные СNV часто встречаются у детей с умственной отсталостью и расстройствами аутистического спектра.

При обследовании указанной выше группы из 54 детей с идиопатической умственной отсталостью и врожденными пороками развития без расстройств аутистического спектра с использованием молекулярного кариотипирования и ДНК-микроматриц, содержащих увеличенное число ДНК-проб на геномные локусы хромосомы Х были выявлены делеции и дупликации различных участков хромосомы Х у 11 (20,4%) детей. Из них 5 (9,3%) были мальчики с несиндромальной Х-сцепленной умственной отсталостью, 4 (7,4%) - девочки с атипичной формой синдрома Ретта, 1 (1,9%) - девочка с несиндромальной Х-сцепленной умственной отсталостью и 1 (1,9%) - девочка с Х-сцепленной формой аутизма. При применении ДНК-микрочипов высокого разрешения (Affimetrics Cytoscan HD, содержащие 2 696 550 олигонуклеотидных проб) было обнаружено, что атипичная форма синдрома Ретта связана с делециями гена МЕСР2 и других, расположенных в участке Хq28 (IRAK1, OPN1LW, TEX28, TKTL1, FLNA, TAZ, ATP6AP1, SLC10A3, IKBKG). Несиндромальная Х-сцепленная умственная отсталость у мальчиков была связана с делециями генов AR (Xq12) и RAB39B (Xq28), а также дупликациями генов ZNF182 (Xp11.23), EDA (Xq13.1) и МЕСР2 (Xq28). У девочки она была ассоциирована с делецией гена UPF3B (Xq24), который, как показано ранее, связан с умственной отсталостью и микроаномалиями развития как мальчиков, так и девочек, несмотря на феномен Х-инактивации (причины асимптоматического носительства Х-сцепленных мутаций у девочек). Х-сцепленная форма аутизма у девочки была ассоциирована с делецией гена нейролигина NLGN4X (Xp22.31), вариации последовательностей ДНК которого рассматриваются в качестве одного из наиболее частых генетических дефектов в генах хромосомы Х при аутистических расстройствах (классический аутизм и синдром Аспергера). Полученные данные подтверждают выдвинутые нами ранее предположения о значительном вкладе Х-сцепленных мутаций (включая CNV) в этиологию умственной отсталости, а также демонстрируют высокую эффективность молекулярного кариотипирования с использованием ДНК-микрочипов, содержащих увеличенное число ДНК-проб на геномные локусы хромосомы Х, при диагностике Х-сцепленной умственной отсталости.

Таким образом, использование новейших методов сканирования генома, основанных на сравнительной геномной гибридизации на ДНК-микрочипах, позволяет с наибольшей эффективностью определять точки разрыва при хромосомных аномалиях и выявлять микроперестройки хромосом.

Array CGH в десятки раз (с 4-5 до 40-50%) повышает эффективность молекулярной диагностики генетических аномалий в группах детей с аутизмом, пороками развития и умственной отсталостью и позволяет также обнаружить новые геномные заболевания [1, 4-6]. При умственной отсталости с аутистическими расстройствами (наиболее частые формы нарушения психики у детей) применение FISH позволило показать, что от 20 до 40% случаев связаны с нарушениями генома, проявляющимися на хромосомном (микроскопический и субмикроскопический) уровне [2, 5]. Выявленные в работе вариации числа копий представляют собой делеции или дупликации какого-либо участка ДНК. Как было отмечено, размер их варьирует от нескольких тысяч до миллионов пар нуклеотидов, и они могут включать от одного до нескольких десятков генов. Подобные вариации генома могут не проявляться фенотипически. Однако CNV, являющиеся, по-видимому, причинными факторами аутизма, чаще всего не обнаруживаются в контрольных группах [4, 5, 14, 18, 29].

Исследования геномных и хромосомных нарушений у детей с аутистическими расстройствами и умственной отсталостью значимы не только для дифференциальной генетической диагностики, но и определения патогенетических механизмов идиопатических форм этих тяжелых социально значимых заболеваний, а также разработки научно обоснованных методов медицинской и психологической коррекции нарушений психики. Проведенное исследование детей с идиопатическим аутизмом и умственной отсталостью является одним из первых в России.

Работа была поддержана грантами DLR/BMBF RUS 11/002, РФФИ №12-04-00215 и Президента России МД-4401.2013.7.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail