В литературе имеется много сообщений о снижении цитотоксической активности (ЦА) лимфоцитов натуральных киллеров (НК) у больных шизофренией. В предыдущих работах авторов статьи [1, 3, 4] также было выявлено снижение уровня ЦА НК при этом заболевании, в частности у больных хронической шизофренией в период обострения. Однако пока остается неясным, на каком этапе развития болезни появляются указанные изменения в иммунной системе больных и какую роль они играют в патогенезе заболевания.

Известно, что активность лимфоцитов НК - один из основных факторов врожденного иммунитета. НК-клетки относят к системе естественной цитотоксичности, которая является первой линией защиты организма человека и животных от разного рода чужеродных воздействий [1, 12], в том числе вирусов и опухолевых клеток. Впервые эти клетки были обнаружены в 1976 г. в лимфоидной ткани крыс и мышей. Они проявляли цитолитическую активность против широкого спектра опухолевых клеток-мишеней. Эта активность выявлялась без какой либо направленной иммунизации животных, поэтому была названа природной, или естественной, киллерной активностью, а обладающие ею клетки - природными, или натуральными, киллерами.

Существует несколько методов оценки ЦА НК-лимфоцитов, в частности колориметрические [7, 8], которые считаются не очень точными [10]. Более современными в этом отношении являются радиометрические методы, например оценка ЦА НК по [³Н]-уридину [5, 6] и другим изотопам [15]. В настоящее время распространен радиоактивный метод оценки ЦА НК, основанный на определении количества [³Н]-РНК в клетках-мишенях, оставшихся недеградированными после их контакта с лимфоцитами НК [6]. В этом методе в качестве клеток-мишеней обычно используют адаптированные к лимфоцитам НК клетки перевиваемой культуры эритролейкемической лимфобластоидной линии человека - К-562, меченные по [³Н]-уридину. Поскольку в результате цитотоксического действия лимфоцитов НК часть клеток-мишеней разрушается на отдельные фрагменты (деградирует) и включившийся в них [³Н]-уридин выходит в окружающую среду, то измерение уровня радиоактивности в оставшихся интактными клетках-мишенях позволяет судить о величине ЦА НК-лимфоцитов. Недостатки таких способов оценки ЦА НК - трудоемкость (использование большого количества приборов и реагентов), продолжительность (2-3 дня) и опасность для здоровья исполнителя (использование радиоактивных веществ и сцинтилляционной жидкости).

Взяв за основу тот же принцип цитотоксического действия НК- лимфоцитов на клетки-мишени К-562, мы применили более простой и безопасный вариант оценки ЦА НК с использованием многофункционального счетчика-анализатора клеток Multisizer MS-4. В этом случае производится подсчет количества оставшихся недеградированными после контакта с лимфоцитами НК клеток-мишеней К-562 и определение их суммарного объема. Поскольку изложенный выше и предлагаемый нами варианты определения ЦА НК основаны на оценке оставшихся недеградированными клеток-мишеней К-562 (в первом случае - по суммарному уровню радиоактивности мишеней, во втором - по количеству мишеней и их суммарному объему), мы имели основание предполагать, что результаты, полученные с помощью предлагаемого способа оценки, должны быть аналогичны таковым, полученным при оценке ЦА НК радиоактивным способом.

Цель настоящего исследования состояла в изучении состояния иммунной системы у больных шизофренией с первым приступом эндогенного психоза с использованием двух указанных методов определения ЦА НК.

Обследовали 16 больных (мужчины) шизофренией с первым приступом эндогенного психоза в возрасте от 18 до 25 лет (средний - 20,8±0,4 года). Все пациенты находились на лечении в клиническом отделении (руководитель - проф. М.Я. Цуцульковская) Отдела по изучению эндогенных психических расстройств и аффективных состояний (руководитель - академик РАМН А.С. Тиганов) Научного центра психического здоровья РАМН.

В контрольную группу входили 8 здоровых.

Иммунологические исследования проводили в лаборатории клинической нейроиммунологии (руководитель - проф. Г.И. Коляскина) и лаборатории клинической биохимии (руководитель - О.С. Брусов) указанного центра.

Радиоактивный метод определения ЦА НК. Базисной моделью для постановки цитотоксического теста служил метод, предложенный М.П. Рыковой и соавт. [6], в нашей модификации [1], основанный на измерении количества ³Н-РНК, оставшейся в меченных ³Н-уридином клетках-мишенях К-562, недеградированных после их инкубации с НК-клетками.

Мишени К-562 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН) поддерживали in vitro в среде RPMI-1640 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) c добавлением 10% фетальной сыворотки (Defined Fetal Bovine Serum фирмы «Hyclone», USA) и 10% глютамина. Непосредственно перед постановкой цитотоксического теста к 3 мл взвеси клеток-мишеней в центрифужной пробирке добавляли 0,3 мл раствора ³Н-уридина (3 мкКи/мл; удельная радиоактивность 24 Ки/мМ, Институт молекулярной генетики РАН). Клетки помещали в термостат при 37 °С на 1 ч. По прошествии этого времени клетки 3 раза отмывали от не включившейся в них радиоактивной метки большими объемами среды 199 с помощью центрифугирования при 1100-1200 об/мин и 4 °С в течение 10 мин (по времени эта процедура занимает еще 1 ч); затем разводили до концентрации 10⁵/мл. Для деградации не включившегося в клетки-мишени К-562 ³Н-уридина к ним добавляли панкреатическую рибонуклеазу А (РНКаза, РЕАХИМ НПО «Биолар»), которая разрезала 3'-конец неспаренных цитидиловых и уридиловых нуклеотидов, катализируя их деградацию.

Мононуклеарные клетки (МНК) - это моноциты и общий пул лимфоцитов в крови человека, 10-15% от которого составляют лимфоциты НК. МНК выделяли общепринятым способом [9] из периферической крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина (уд. пл. 1,077), разводили их средой 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) до концентрации 4·10⁶/мл.

Постановку цитотоксического теста осуществляли в специальных 96-луночных круглодонных полистироловых планшетах (объем лунки - 0,25 мл, завод «Медполимер», Санкт-Петербург); в лунки с опытными пробами вносили 0,05 мл среды 199, 0,05 мл полной среды 199, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% раствором глютамина, затем добавляли в соотношении 20:1 0,05 мл взвеси МНК больных и 0,1 мл обработанных ³Н-уридином и РНКазой клеток-мишеней К-562.

В лунки с контрольными пробами вместо МГК больных добавляли 0,05 мл среды 199. Каждую опытную и контрольную пробы ставили в двух или трех параллельных лунках. Планшеты инкубировали в термостате в течение 16-18 ч при температуре 37 °С и 5% СО2. После инкубации клетки переносили с помощью многоканального харвестера («Сombi cell Harvester Skatron», England) - прибора для сбора клеток методом фильтрации на фильтрах и вакуумного насоса (фирма «Millipore») из планшетов на специальные стекловолокнистые фильтры для харвестера («Skatron, Filter Mat for 12 well Cell Harwesters», England) и отмывали натрий-фосфатным буфером от невключившейся метки. Фильтры высушивали на воздухе в течение 18 ч, после чего помещали в сцинтилляционные флаконы («Beckman», USA). В вытяжном шкафу c помощью диспенсера («Brinkmann», Germany) наливали в каждый флакон по 3 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8 (Институт «Монокристалл», Украина) и оставляли еще на 18 ч для выхода β-частиц. После этого сцинтилляционные флаконы помещали в жидкостной сцинтилляционный счетчик β-частиц (MicroBeta trilux, «PerkinElmer Inc.») и подсчитывали количество радиоактивных импульсов в каждом флаконе.

В формулу для расчета цитотоксической активности лимфоцитов НК вносили значения радиоактивности, полученные во флаконах с опытными и контрольными образцами, и результат выражали в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в процентах, который рассчитывали по формуле:

Метод определения ЦА НК с помощью многофункционального счетчика и анализатора клеток. Оценку ЦА НК новым способом по количеству и объему недеградированных после инкубации с НК клеток-мишеней К-562 проводили на многофункциональном счетчике-анализаторе клеток типа Multisizer MS-4 («Beckman Coulter», USA). Прибор позволяет анализировать количество и размер частиц, их суммарный объем, производить анализ распределения частиц по размерам. Принцип его работы заключается в прохождении суспендированных в электролите клеток через апертуру малого диаметра, расположенную между двумя электродами (принцип Культера). Когда клетки проходят через апертуру - «чувствительную зону», каждая из них вытесняет определенное количество электролита, вызывая возрастание сопротивления. В результате происходит небольшое изменение величины электрического тока в усилителе, который преобразует колебания силы тока в импульсы напряжения, находящиеся в прямой зависимости от диаметра прошедшей через апертуру клетки. Кроме того, прибор устроен так, что может вычислять и суммарный объем прошедших через апертуру клеток. При этом на экране монитора можно визуально выделить любой размерный диапазон, соответствующий диаметру определенных клеток. В нашем варианте прибор настраивали на выявление клеток, диаметр которых находился в диапазоне от 15 до 40 мкм. Это соответствовало диаметру клеток-мишеней К-562, который превышает диаметр (не достигает 15 мкм) самых крупных клеток крови - моноцитов. С помощью этого прибора уровень ЦА НК подсчитывали по количеству не деградированных после контакта с лимфоцитами НК клеток-мишеней К-562, а также их суммарному объему.

Выделение МНК из крови больных и постановку цитотоксического теста проводили согласно описанной выше методике с той разницей, что клетки-мишени К-562 перед инкубацией с МНК не обрабатывали 3Н-уридином и РНКазой. После культивирования содержимое параллелей каждой пробы с помощью автоматической пипетки переносили из планшета для культивирования в пластиковые пробирки типа «Ependorf», тщательно перемешивали; из каждой пробирки отбирали 100 мкл клеточной взвеси и разводили в специальных акуветах в 10 мл жидкости для разведения (прилагаются к прибору). Акуветы помещали в анализатор, в котором подсчитывали клетки (результаты подсчета выводились на экран монитора). В акуветах с контрольными и опытными пробами подсчитывали число клеток и их суммарный объем. В опытных пробах количество клеток К-562 и их суммарный объем существенно ниже, чем в контрольных, что полностью подтверждает возможность оценки ЦА НК по количеству мишеней К-562, оставшихся недеградированными после контакта с лимфоцитами НК, и их суммарному объему.

Активность НК клеток рассчитывали по приведенной выше формуле и выражали также в виде ИЦ, только в числитель и знаменатель вместо числа импульсов, измеряемых в интактных клетках-мишенях, вносили их число или объем:

Для большей доказательности сравнимости результатов, получаемых двумя способами оценки ЦА НК цитотоксический тест ставили в параллельных пробах в трех вариантах: 1) использование исходной взвеси МНК, содержащей все мононуклеарные клетки, включая моноциты; 2) добавление непосредственно перед постановкой опытов в инкубационную смесь (взвесь МНК+клетки-мишени) серотонина, который, как известно из литературы, оказывает влияние на НК-активность [14]. В нашей работе он использовался в концентрациях 10^-6 М (вариант 2а), 10^-7 М (вариант 2б) и 10^-9 М (вариант 2в), 3) использование взвеси МНК без моноцитов, которые удаляли методом адгезии [2], поскольку известно, что моноциты также могут влиять на активность НК-клеток [11, 13].

Для обработки результатов исследования использовали программу Statistica, версия 6 («Statsoft Inc.», США). При сравнении различных групп использовали критерий U Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с использованием r-критерия Спирмена.

В общей группе больных шизофренией с первым приступом эндогенного психоза (табл. 1) уровень ЦА НК, определяемый радиоактивным способом в культуре клеток с моноцитами (вариант 1), был достоверно снижен по сравнению с контролем (p<0,05); это свидетельствует, что снижение уровня ЦА НК у больных шизофренией происходит уже к моменту первой манифестации болезни.

ЦА НК у этих же больных в культуре клеток с моноцитами (вариант 1) на анализаторе с помощью подсчета количества интактных мишеней и их суммарного объема не было выявлено статистически значимых различий между средними значениями показателя, полученными двумя способами оценки. Добавление в культуры клеток с моноцитами серотонина в концентрациях 10^-6 и 10^-7 М (варианты 2а и 2б) не изменяло уровень ЦА НК, серотонин в концентрации 10^-9 М (вариант 2в) достоверно его повышал (p<0,05), тогда как удаление моноцитов из взвеси МНК (вариант 3) приводило к достоверно выраженному снижению (p<0,05). Отмеченные изменения уровня ЦА НК выявлялись также при обоих способах его оценки и статистически достоверно не отличались друг от друга (см. табл. 1).

Подтверждением полученных результатов служило выявление в общей группе больных ряда статистически значимых (p<0,05) положительных корреляций в культуре с моноцитами (вариант 1): между уровнем ЦА НК, определяемым по радиоактивности в недеградированных мишенях К-562, с одной стороны, и количеством (r=0,6; p<0,05), а также суммарным объемом этих клеток (r=0,56; p<0,05), определяемым с помощью анализатора, - с другой. При этом между количеством оставшихся мишеней и их суммарным объемом также выявлялся высокий уровень положительной корреляционной связи (r=0,95; p<0,001). В культуре без моноцитов (вариант 3) были получены аналогичные результаты: положительная корреляция между уровнем ЦА НК, определяемым по ³Н-уридину в недеградированных клетках-мишенях, и их количеством (r=0,95; p<0,001), а также суммарным объемом (r=0,97; p<0,001), определяемым с помощью анализатора. Положительные корреляции между значениями ЦА НК, полученными при оценке с использованием ³Н-уридина и подсчете на анализаторе количества (r=0,81; p<0,001), а также суммарного объема оставшихся в культуре мишеней (r=0,81; p<0,001), выявлялись также при добавлении в культуры клеток с моноцитами серотонина во всех исследуемых концентрациях (вариант 2).

При индивидуальном анализе в общей группе больных были выявлены значительные колебания показателей значений ЦА НК (ИЦ определялся от 10,1 до 65,9%). Поэтому всех пациентов для получения более однородных групп дополнительно распределили дихотомически по значению медианы в две равные подгруппы: с высоким (на уровне контроля) и низким (достоверно сниженный относительно контроля, p<0,05) уровнем ЦА НК. При сравнении результатов, полученных двумя способами оценки ЦА НК в каждой из подгрупп (табл. 2), было выявлено сходство результатов, аналогичное таковому в общей группе больных.

Таким образом, способ определения ЦА НК по количеству и объему недеградированных после контакта с лимфоцитами НК клеток-мишеней К-562 на многофункциональном счетчике-анализаторе клеток типа Multisizer MS-4 позволяет получить результаты, аналогичные определяемым с использованием метода оценки ЦА НК по радиоактивности [2]. При этом простота оценки ЦА НК предлагаемым способом и меньшая его стоимость (используется меньшее количество приборов и реагентов), безопасность для исследователя (исключается использование радиоактивных компонентов и сцинтилляционной жидкости) и существенное снижение затрат времени (10-15 мин вместо 2-3 дней) свидетельствуют о возможности его использования в повседневной научной и клинической практике.