В настоящее время существует несколько перспективных фармакологических агентов, обладающих плейотропным воздействием при травматической патологии головного мозга. К ним относятся статины, прогестерон, циклоспорин А, дикетопиперазины, антагонисты субстанции P, ингибиторы каспаз и поли-АДФ-рибоза-полимеразы, а также комбинации нейротрофических факторов и нейропептидов на основе экстрактов вещества головного мозга [9]. При этом за последние 5 лет отмечено значительное возрастание интереса к применению последних при неврологической патологии, что связано с раскрытием целого ряда молекулярных механизмов их нейротрофического и нейропротективного действия [12]. К таким механизмам относятся: 1) ингибирование каспаз-ассоциированного апоптоза; 2) ингибирование кальций-зависимых кальпаиновых протеаз; 3) уменьшение выработки свободных радикалов; 4) предотвращение деградации клеточного цитоскелета; 5) уменьшение продукции ?-амилоида; 6) стимуляция нейро- и синаптогенеза; 7) ингибирование синтеза белков теплового шока; 8) ингибирование глютаматной эксайтотоксичности; 9) уменьшение проницаемости и поддержание метаболизма гематоэнцефалического барьера.

Одним из наиболее известных препаратов, созданных на основе экстрактов головного мозга, является церебролизин, обладающий разносторонним действием как in vitro, так и in vivo [3-8, 10, 13-18, 20-22].

В литературе имеется достаточно большое число данных, свидетельствующих о перспективности использования церебролизина в качестве нейропротективного и нейрорегенеративного средства. Более того, есть основания предположить его влияние на неспецифические системы гомеостаза - регуляцию перекисного окисления липидов (ПОЛ), функцию вторичных и внутриклеточных мессенджеров, а также регуляцию мезенхимально-тканевой реакции на повреждение.

Цель данной работы - исследование влияния церебролизина на поведение, процессы ПОЛ, систему вторичных и внутриклеточных мессенждеров, а также морфологические процессы повреждения и регенерации нервной ткани у крыс с экспериментальным фокальным повреждением коры головного мозга.

Работа выполнена на 32 взрослых белых крысах-самцах массой 200-300 г. Животные содержались в пластиковых клетках изолированно друг от друга при естественном освещении, температуре воздуха около 20-22 °С, свободном доступе к пище и воде.

Критериями отбора животных наряду с массой тела и полом являлись их общее состояние, активное поведение, гладкая блестящая шерсть и чистый кожный покров, отсутствие внешних признаков заболеваний.

Экспериментальные животные были случайным образом разделены на 2 группы: 1-я группа (основная) состояла из 16 крыс, получавших церебролизин; 2-я группа (контрольная) включала 16 животных, не получавших никаких препаратов.

После разделения на группы всем экспериментальным животным было проведено неврологическое тестирование - оценка сложного двигательного поведения по методике D. Combs и L. D'Alecy [2], включающей тесты с наклонной проволочной платформой, удержания равновесия на горизонтальном стержне и при подвешивании на горизонтально натянутой проволоке.

Далее животным 1-й группы внутрибрюшинно вводили церебролизин в дозе 215,2 мг/кг в сутки. Через 14 дней вновь выполнялось неврологическое тестирование, после чего у 6 животных из каждой группы в плазме крови определяли интенсивность процесса ПОЛ, а у 10 животных из каждой группы воспроизводили модель фокального повреждения коры головного мозга. Через 14 дней с момента создания модели выполнялось заключительное неврологическое тестирование, после чего крысы были эвтаназированы передозировкой хлоралгидрата (700 мг/кг внутрибрюшинно) и декапитированы с целью проведения гистологического исследования ткани головного мозга.

Для определения интенсивности процессов ПОЛ кровь получали при декапитации животных под глубоким хлоралгидратным наркозом. Определение этих процессов проводили методом индуцированной хемилюминесценции, оценивая содержание свободных радикалов. Антиоксидантный потенциал крови измеряли в плазме крови с помощью биохемилюминометра БХЛ-07 [1]. Концентрации нитрит-ионов в крови измеряли спектрофотометрическим методом спектрофотометром СФ-2000 [11].

За 1 сут перед созданием модели фокального поражения коры головного мозга крысы в течение 12 ч голодали при свободном доступе к воде. Повреждение коры головного мозга проводили под хлоралгидратным наркозом (350 мг/кг внутрибрюшинно) после депиляции в асептических условиях разреза кожи и трепанации черепа. Делался продольный разрез ткани головного мозга крысы в левой теменной доле глубиной 2 мм, длиной 3 мм с последующим ушиванием кожной раны в проекции трепанационного отверстия.

После окончания опыта и декапитации животного выполнялось исследование полости черепа, включающее скальпирование, отделение с помощью ножниц с острыми браншами костей свода черепа вместе с твердой мозговой оболочкой, после рассечения намета мозжечка выделение головного мозга на уровне ствола. В течение 3 сут головной мозг фиксировался в 10% растворе забуференного формалина, затем рассекался на пластины толщиной 3 мм во фронтальной плоскости с выделением зоны операционного повреждения. После обезвоживания в этиловом спирте, ксилоле изготавливались парафиновые блоки.

Патогистологическое исследование головного мозга проводилось на сериальных срезах толщиной 5-6 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа (ШИК-реакция). Для получения микрофотографий использовался исследовательский микроскоп «Micros» на анализаторе изображений «BioVision» (Австрия).

Статистическая обработка проводилась с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0. Учитывая, что большинство совокупностей данных имели распределение, отличное от нормального, для характеристики центральной тенденции значений была использована медиана. Для попарного сравнения независимых групп применялся критерий Манна-Уитни, для сравнения зависимых групп - критерий Вилкоксона и критерий знаков, для сравнения долей - критерий χ², для оценки связи двух показателей - критерий ранговой корреляции Спирмена.

Исходные показатели сложного двигательного поведения в основной и контрольной группах не имели значимых различий. Через 14 дней эксперимента указанные показатели также остались без изменений как при сравнении в динамике, так и между животными обеих исследуемых групп. Через 2 нед после модели фокального повреждения головного мозга в обеих группах выявлено снижение показателей сложного двигательного поведения по сумме баллов в отдельных тестах (с наклонной проволочной платформой, удержания равновесия на горизонтальном стержне, подвешивания на горизонтально натянутой проволоке). Общая сумма баллов была достоверно (p<0,008) выше в группе животных, получавших церебролизин, по сравнению с контролем (рис. 1).

Полученные данные говорят о меньшем неврологическом дефиците у животных основной группы после воспроизведения модели фокального повреждения головного мозга, что согласуется с результатами ранее проведенных исследований.

После 14 дней введения церебролизина получены значительные различия в показателях антиоксидантного статуса у крыс основной и контрольной групп. У животных, получавших церебролизин, отмечено снижение показателей хемилюминесценции сыворотки крови (Imax - максимальная интенсивность хемилюминесценции - отражает потенциальную способность биологического объекта к свободнорадикальному окислению, S - светосумма хемилюминесценции - отражает содержание радикалов RO2, соответствующих обрыву цепи свободнорадикального окисления) показывающих возможность оценить систему ПОЛ - антиоксидантной активности (p<0,05) (рис. 2, 3).

Полученные результаты говорят о значительном влиянии церебролизина на процессы ПОЛ и активность антиоксидантной системы. Уменьшение интенсивности максимального свечения (Imax) и светосуммы хемолюминисценции (S) указывают на выраженное снижение процессов образование активных радикалов кислорода. Кроме того, значимое повышение tg2 говорит о повышении активности компонентов антиоксидантной системы. Это дало основание сделать вывод, что церебролизин обладает регуляторным действием на про- и антиоксидантные процессы у животных вне экспериментального оксидантного стресса, что, возможно, является одним из компонентов его нейропротективного действия.

На 14-й день эксперимента было выявлено достоверное (p=0,0005) снижение по сравнению с контролем содержания нитрит-ионов в основной группе животных (рис. 5).

Учитывая, что предложенная в опыте модель повреждения головного мозга должна привести к формированию локальной зоны некроза коры большого полушария, были выбраны следующие морфологические критерии состояния поврежденного головного мозга на 14-е сутки после операции: 1) выраженность и характер повреждения нейронов; 2) выраженность макрофагальной реакции и лимфоцитарной инфильтрации в зоне повреждения; 3) перифокальная реакция со стороны микроциркуляторного русла (неоангиогенез); 4) уровень развития мезенхимально-клеточной реакции (формирование глиомезодермального рубца). Прогнозируемым побочным эффектом явилось кровоизлияние в зону некроза вследствие повреждения пиальных артерий и вен, которое проявилось в 70% от общего числа наблюдений.

Результаты морфологического исследования оказались следующими. У животных контрольной группы через 14 дней после операции в краях разреза головного мозга наблюдалось тотальное повреждение нейроцитов, среди которых преобладали «темные» (пикноморфные) формы. Макрофагальная реакция хорошо выражена с образованием «зернистых шаров» (макрофагов, цитоплазма которых нафарширована липидами). В наблюдениях, где травма головного мозга не сопровождалась кровоизлиянием, заметно было образование микрокист. Хорошо выраженная реакция макроглии проявлялась в формировании вала на границе некроза из «тучных» астроцитов с зернами гемосидерина. Зона некроза была обильно инфильтрирована лимфоцитами, инфильтрат в основном состоял из плазматических клеток. В пограничной зоне были видны отдельные новообразованные капилляры.

В группе животных, получавших церебролизин, в большинстве наблюдений отмечалась гибель лишь части нейронов, сопровождающаяся такими необратимыми изменениями нервных клеток, как гиперхроматоз ядра, хроматолиз и вакуолизация цитоплазмы. Выявлялось значительное количество нейронов с признаками обратимости ишемических изменений [1]. У таких «светлых» форм нейронов наблюдалось побледнение ядерной мембраны и помутнение нуклеоплазмы. На границе зоны некроза выявлялись единичные макроглиальные элементы. Воспалительная инфильтрация носила очаговый характер и проявлялась формированием лимфоцитарных муфт вокруг многочисленных новообразованных капиллярных петель. Процессы организации в зоне повреждения характеризовались появлением очагов глиомезодермальной реакции в 60% наблюдений.

Таким образом, при исследовании головного мозга крыс, получавших препарат церебролизин, выявлена сравнительная устойчивость нейронов к повреждению; кроме того, характер гибели нервных клеток с преобладнием «светлых» форм свидетельствовали об отсроченности развития необратимой стадии некроза.

Репаративные изменения нервной ткани характеризовались выраженной капилляризацией зоны повреждения и началом формирования глиомезодермального рубца.

Общие выводы по результатам проведенного исследования могут быть сформулированы следующим образом. Препарат церебролизин обладает нейропротективным действием в условиях экспериментального фокального повреждения головного мозга. Применение церебролизина приводит к снижению интенсивности процессов ПОЛ и повышению активности антиоксидантной системы. Влияние церебролизина на систему вторичных клеточных посредников, в том числе NO, может быть дополнительным важным механизмом, обеспечивающим нейропротективное и нейротрофическое действие препарата. Использование церебролизина в условиях повреждения головного мозга снижает количество гибнущих нейронов и способствует ускорению репарации в зоне некроза нервной ткани.