Проблема структурно-функционального восстановления мозга после гипоксии/ишемии является одной из наиболее актуальных в физиологии и медицине. С целью терапии постинсультных/постгипоксических расстройств широко применяются ноотропные пептидергические препараты, которые направлены на защиту нейронов от повреждающего действия лактацидоза, подавление окислительного стресса и предотвращение гибели нейронов в условиях гипоксии и ишемии [6]. Наиболее эффективными из подобных препаратов в России считают церебролизин и кортексин [1], однако это не всегда подтверждается в клинической практике [9, 14]. Следует учитывать, что они представляют собой пептидные вытяжки из тканей сельскохозяйственных животных (головной мозг свиней, телят), а применение подобных средств вызывает опасения во многих странах мира из-за опасности переноса прионных болезней [11]. Поэтому очевидной остается необходимость поиска новых, более эффективных и без­опасных средств лечения постгипоксических/ишемических расстройств.

В связи со сказанным авторами была предпринята разработка немедикаментозного метода нейропротекции, основанного на применении создаваемой в барокамере умеренной гипобарической (высотная) гипоксии, получившего название гипоксическое посткондиционирование^[1]. В наших исследованиях была доказана его эффективность в отношении коррекции постгипоксических повреждений нейронов мозга после тяжелого гипоксического воздействия в моделях на лабораторных животных (крысы) [12].

Цель настоящего исследования - сравнительный анализ эффективности нейропротективного действия гипоксического посткондиционирования и препарата церебролизин.

В модели гипобарической гипоксии на крысах, переживших тяжелое летальное гипоксическое воздействие и затем подвергавшихся гипоксическому посткондиционированию или терапии церебролизином, проводилась оценка объема нейрональных повреждений гиппокампа и неокортекса, а также расстройств поведения и гормональных функций у животных.

Работа была проведена на взрослых самцах крыс линии Вистар весом 200-250 г. Животные были выращены в стандартных условиях вивария Института физиологии им. И.П. Павлова РАН и содержались в лабораторных условиях при свободном доступе к воде и пище. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества (86/609/EEC) об использовании животных для экспериментальных исследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

В работе использовали 6 групп животных: 1-я группа - контроль-1 (к процедуре гипоксии): крыс помещали в барокамеру на 3 ч без создания гипоксии; 2-я группа - контроль-2 (к процедурам инъекций): животных помещали в барокамеру на 3 ч без создания гипоксии и затем вводили ежедневные инъекции физиологического раствора в течение 3 дней; 3-я группа - тяжелая гипоксия (ТГ): животных помещали в барокамеру проточного типа при давлении 180 мм рт.ст., что соответствует подъему на высоту 11 000 м, на 3 ч; 4-я группа - ТГ с посткондиционированием (ТГ+ПостК): крыс, переживших ТГ, подвергали сеансам умеренной гипоксии на 1, 2, 3-й дни после ТГ; 5-я группа - ТГ с терапией церебролизином (ТГ+Ц): крысам, пережившим ТГ, вводили церебролизин на 1, 2, 3-й дни после ТГ; 6-я группа - терапия церебролизином (Ц): животных помещали в барокамеру на 3 ч без создания гипоксии и затем вводили ежедневные инъекции церебролизина в течение 3 дней.

В условиях ТГ погибало около 50% животных. Гипоксическое ПостК осуществляли путем 3-кратного воздействия умеренной гипобарической гипоксией, длительностью 2 ч, с интервалами 24 ч между сеансами. При этом давление в барокамере составляло 360 мм рт.ст., что соответствовало подъему на высоту 5000 м. Ранее данные параметры умеренной гипобарической гипоксии успешно применяли в режиме прекондиционирования для повышения неспецифической толерантности мозга и индукции базисных нейропротективных механизмов [3-5]. ПостК начинали через 24 ч после ТГ. В 5-й группе через 24 ч после ТГ начинали производить ежедневные инъекции церебролизина («Эбеве Фарма/Биоком», 1 мл/кг, №3, внутрибрюшинно). Еще одну группу крыс (6-я группа) помещали в барокамеру при отсутствии гипоксического воздействия и затем вводили церебролизин по аналогичной схеме (на 1, 2, 3-й дни после помещения в барокамеру). Поведение животных исследовали в тестах «открытого поля» (ОП) и приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) на 5-й и 6-й дни после ТГ (3-я, 4-я, 5-я группы) или помещения в барокамеру без создания гипоксии (1-я, 2-я, 6-я группы) соответственно. ОП представляло собой квадратную арену размером 120×120 см с высотой борта 40 см, освещенную лампой 100 Вт, расположенной над центральными квадратами на высоте 70 см. Тестирование проводили в течение 5 мин; регистрировали число пересеченных центральных и периферических квадратов, стоек, время неподвижности (иммобилизация) и груминга. Анализировали также количество выходов в центр. ПКЛ представлял собой установку из двух открытых освещенных (50×10 см) и двух закрытых (50×10×40 см) неосвещенных рукавов, расположенную на высоте 1,5 м от пола. В ПКЛ в течение 5 мин регистрировали время пребывания в открытых рукавах и центре, число стоек, а также продолжительность замираний и груминга.

Содержание глюкокортикоидных гормонов (кортикостерон) в крови определяли в покое (базальный) и в ответ на стресс новизны (тест ОП) (через 30 мин после помещения в установку ОП). Реактивность гипофизарно-адренокортикальной системы (ГАС) определяли как соотношение стрессового и базального уровней кортикостерона, выраженное в процентах. На 7-й день после ТГ (3-я, 4-я, 5-я группы) или помещения в барокамеру и без создания гипоксии (1-я, 2-я группы) крыс декапитировали. После этого производили изъятие и гистологическую обработку тканей мозга.

Полученные образцы фиксировали в молекулярном фиксаторе FineFIX («Milestone», Италия) в течение 24 ч, затем заливали в парафиновые блоки по стандартному гистологическому протоколу. Далее при помощи микротома изготавливали серии чередующихся срезов мозга во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на уровне –2.80 от брегмы [10]. Для визуализации нейронов мозга использовали метод окраски по Нисслю. Полученные срезы исследовали на морфометрической установке, состоящей из светового микроскопа Jeneval («Carl Zeiss», Германия), цифровой камеры Baumer CX05c («Baumer Optronic», Германия) и компьютера IBM PC с программным обеспечением ВидеоТест Мастер Морфология (разработка ООО «Видео Тест», Санкт-Петербург). Подсчитывали число выживших пирамидных нейронов в зонах гиппокампа СА1 и СА4 длиной 460 мкм с учетом их изгиба (объектив 40×), области V слоя неокортекса, число выживших нейронов подсчитывали в поле зрения площадью 460×40 мкм (объектив 40×). Все результаты обрабатывали статистически по критерию Манна-Уитни (пакет анализа Statistica), изменения считали достоверными при p≤0,05. На рисунках результаты представлены в процентах по отношению к значениям в соответствующей контрольной группе: для 3-й и 4-й групп - контроль-1, 5-й и 6-й - контроль-2. Значения в контрольных группах в обоих случаях принимались за 100%.

Воздействие тяжелой гипобарической гипоксии (ТГ) оказывало значительный повреждающий эффект на уязвимые нейроны мозга (гиппокамп, неокортекс), о чем свидетельствовало значимое снижение количества пирамидных нейронов в этих образованиях мозга через 7 сут (рис. 1). В отличие от этого ПостК способствовало выживанию после ТГ 100% нейронов в V слое неокортекса и зоне гиппокампа СА4. В поле СА1 число выживших нейронов было несколько ниже контрольных значений, однако значительно выше, чем у непосткондиционированных животных (см. рис. 1). Инъекции церебролизина животным, пережившим ТГ, не влияли на выживаемость наиболее уязвимых пирамидных нейронов гиппокампа в поле СА1, однако оказывали полноценный нейропротективный эффект в области гиппокампа СА4 и неокортексе (см. рис. 1).

Результаты поведенческих и гормональных тестов показали, что ТГ вызывала ряд функциональных нарушений у крыс. В частности, пережившие ТГ животные характеризовались резким снижением активности в центре ОП, а также в центре и открытых рукавах ПКЛ, что свидетельствует о повышении у этих крыс уровня тревожности (рис. 2, А; рис. 3, а, б). Введение церебролизина не снижало анксиогенного влияния ТГ, наряду с этим подавляя также двигательную активность животных, что проявлялось в достоверном снижении периферической и вертикальной (стойка) двигательной активности и увеличении времени неподвижности (иммобилизация) в поведенческих тестах (см. рис. 2, б, в, г; рис. 3, в, г). В отличие от этого ПостК оказывало значительный анксиолитический эффект, проявлявшийся в нормализации центральной активности в ОП, времени пребывания в открытых рукавах и центре ПКЛ и др. (см. рис. 2 и рис. 3). Введение церебролизина животным группы контроля, не подвергавшимся ТГ, достоверно подавляло центральную и периферическую активность в ОП (см. рис. 2, а, б).

Наряду с этим у животных, перенесших ТГ, наблюдались нарушения гормональных функций, в частности активности ГАС и ее реактивности на слабый стресс (стресс новизны). ТГ приводила к достоверному стойкому снижению базального уровня кортикостерона (основной глюкокортикоидный гормон у крыс) в плазме крови и увеличению амплитуды его стрессорного выброса через 30 мин после переноса крыс в новую обстановку (рис. 4, а). Соответственно реактивность ГАС (соотношение стрессорного уровня гормона к базальному, выраженное в процентах) превышала у этих животных 1000%, тогда как в норме составляла 310% (см. рис. 4, б). ПостК нормализовало базальный уровень гормона и достоверно снижало амплитуду его стрессорного выброса, реактивность ГАС в этом случае равнялась 363% (см. рис. 4). Аналогичное действие у гипоксических животных оказывал церебролизин, однако у крыс, не подвергавшихся гипоксии, препарат оказывал парадоксальный эффект - у животных отмечались сходные изменения параметров активности и реактивности ГАС, как и после ТГ (см. рис. 4).

Таким образом, в наших исследованиях было установлено нейропротективное действие церебролизина.

У переживших ТГ крыс он предотвращал гибель нейронов СА4 области гиппокампа и неокортекса, а также нормализовал гормональную функцию ГАС, но при этом неблагоприятно влиял на поведение. ПостК с применением умеренной гипобарической гипоксии оказывало не только значительный нейропротективный эффект, улучшая выживаемость нейронов мозга во всех исследованных образованиях, но и восстанавливало функциональные характеристики по данным поведенческих и гормональных тестов. По эффективности разработанный нами немедикаментозный способ нейропротекции превосходил церебролизин. Следует принимать во внимание, что курс терапии препаратом в наших экспериментах был короче, чем рекомендовано в проведенных исследованиях [7]. При сравнительном анализе эффективности различных терапевтических стратегий необходимо учитывать не только выраженность эффекта, но и продолжительность курса, необходимого для достижения оптимального результата. На этом основании в настоящей работе мы ограничили длительность воздействий 3 сут после повреждающего воздействия, показав, что этого периода достаточно для проявления полноценного протективного эффекта в случае гипоксического ПостК, но не церебролизина. Более того, оказалось, что даже 3-кратная инъекция данного препарата может приводить к ряду нежелательных эффектов на поведение и гормональную регуляцию. В частности, в наших экспериментах церебролизин способствовал развитию тревожно-депрессивной симптоматики, а также сверхреактивности ГАС даже на слабый стресс - у «здоровых» животных. Последнее может рассматриваться как патологическая реакция, поскольку для оптимальной мобилизации адаптивных ресурсов, обеспечивающей адаптацию к стрессу, необходимо, чтобы реактивность ГАС была адекватной действующему стрессору. Как недостаточная активация, так и сверхреактивность к слабым стрессорам отражают патологический профиль функционирования ГАС, приводящий к дезадаптивным состояниям [8]. Кроме того, высокие концентрации глюкокортикоидов вследствие увеличения их стрессорного выброса могут оказывать токсическое действие на органы и ткани, в особенности нейроны головного мозга [13].

Изложенное выше позволяет сделать заключение, что ПостК путем нескольких сеансов умеренной гипобарической гипоксии оказывает благоприятное действие, улучшая структурно-функциональную реабилитацию после тяжелой гипоксии. Ранее аналогичные параметры умеренной гипоксии мы успешно применяли для индукции гипоксической толерантности мозга и неспецифической резистентности к факторам негипоксической природы, в частности психоэмоциональным и травматическим стрессам [5]. Были выявлены базисные гормональные и внутриклеточные каскадные механизмы с вовлечением ключевых регуляторных систем, гормональных и медиаторных рецепторов, генома, проадаптивных белков, посредством которых реализуется нейропротективное действие 3-кратной умеренной гипобарической гипоксии, применяемой в настоящей работе в качестве ПостК [5]. Экспериментальные результаты, в том числе полученные в данном исследовании, свидетельствуют, что мощное протективное действие умеренной гипобарической гипоксии проявляется и при ее предъявлении не только до, но и после повреждающего воздействия. Эти данные могут способствовать созданию новых способов баротерапии, основанных на использовании умеренной гипобарической гипоксии в определенном режиме. В настоящее время гипобаротерапия широко используется в клинике для лечения различных сердечно-сосудистых, эндокринных и аллергических заболеваний, бронхиальной астмы, синдрома хронической усталости и др. [2], однако при этом применяются схемы воздействий, отличающиеся от предложенных нами. Распространенный метод гипобаротерапии основан на адаптации к действию умеренной гипобарической гипоксии, аналогичной встречающейся в естественных горно-климатических условиях на высоте около 3,5 км и известной своим благоприятным воздействием на организм. Однако использование гипобарической гипоксии в режиме пре- и посткондиционирования принципиально отличается от данного метода прежде всего тем, что требуется не 15-20 сеансов, как при гипобаротерапии, а только несколько сеансов умеренной гипобарической гипоксии по определенной схеме. В этом случае протективный эффект достигается не за счет длительной адаптации к условиям разреженного воздуха, а в результате срочной активации защитных механизмов мозга и организма в целом [5].

Таким образом, полученные в работе данные показывают, что новый способ гипоксического посткондиционирования, разработанный в экспериментальных моделях, обладает рядом преимуществ перед эталонным препаратом-нейропротектором церебролизином в отношении эффективности и выраженности побочного действия. Они свидетельствуют, что гипоксическое посткондиционирование с применением умеренной гипобарической гипоксии в определенном режиме является перспективным способом реабилитации после действия гипоксии/ишемии, который после дополнительных исследований на приматах может быть внедрен в медицинскую практику.

Исследования проведены при поддержке РФФИ (грант №10-04-00371).