Церебролизин - широко применяемый в клинической практике препарат с выраженным нейротрофическим [23], нейропротективным, нейромодулирующим [17, 24], усиливающим оксидативный метаболизм [16] действием и витаминной активностью [2]. Его эффективность при сосудистых и дегенеративных заболеваниях, а также повреждениях ЦНС подтверждена в многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях [3, 7, 8, 13, 14, 15, 20]. Имеются публикации [1, 4, 6, 9], свидетельствующие о эффективности церебролизина в лечении травм и заболеваний периферической нервной системы. По сравнению со стероидными препаратами, витаминами и антиоксидантами, препарат достоверно ускорял купирование неврологической симптоматики [22]. Эксперименты на биологических моделях повреждения и регенерации периферических нервов свидетельствуют о повышении эффективности реиннервации при интратекальном [18] и параневральном [11] введении церебролизина. Установлено его положительное влияние на восстановление и поддержание структурных параметров регенерирующих нервных волокон, врастающих в дистальный отрезок нерва [11], а также васкуляризацию реиннервируемых мышц [12], которое продолжается по крайней мере в течение 2,5 мес после отмены препарата. Однако отдаленные результаты регенерации периферических нервов при адъювантной терапии церебролизином изучены недостаточно, противоречива информация и о зависимости его эффективности от схемы применения.

Цель исследования - анализ влияния церебролизина на динамику и отдаленные результаты регенерации периферического нерва после перерезки и микрохирургического шва в зависимости от схемы параневрального введения.

Исследование было проведено на 56 взрослых беспородных собаках, 53 из которых были оперированы под внутривенным барбитуровым наркозом в асептических условиях операционной. Обнажали седалищный нерв на уровне средней трети бедра, затем выполняли его полную перерезку ножницами и делали эпипериневральный шов с применением микрохирургической техники. Использовали инструментарий фирмы «Aesculap AG» (Германия), нити фирмы «Ethicon LTD», Великобритания (марка 8/0 Ethilon) при оптическом увеличении 8-16 операционного микроскопа Zeiss OPMI-6 фирмы «Opton» (Германия).

В опытной группе было 24 животных, которым в период от 3 дней до 1,5 мес после операции проводили курс из 20 инъекций церебролизина («EVER Neuro Pharma», Австрия). Препарат вводили по 0,5 мл параневрально в область седалищной вырезки - на 3-4 см проксимальнее зоны перерезки и шва нерва. В зависимости от схемы применения церебролизина (Сer) опытная группа была разделена на две подгруппы (Cer1 и Cer2). В подгруппе Cer1 инъекции выполняли 5 раз в неделю, а в подгруппе Cer2 - 3 раза. Животных эвтаназировали через 2,5, 4, 6 и 12 мес после операции с целью проведения морфологических исследований.

В контрольной группе, состоявшей из 26 животных, каких-либо воздействий на процесс регенерации седалищного нерва в послеоперационном периоде не применяли. Морфологические исследования были проведены в те же сроки после операции, что и в опытной группе.

В группе сравнения (3 животных) провели опыты с параневральным введением физиологического раствора в объеме 0,5 мл по схеме, аналогичной в подгруппе Cer1. В этих случаях опыт был закончен через 4 мес после операции.

Кроме указанных групп, имелась также группа из 3 интактных животных.

При проведении экспериментальных исследований руководствовались требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983, №267 МЗ РФ от 19.06.2003, «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных», утвержденными МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977), принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996).

Для гистологического исследования иссекали седалищный нерв в пределах оперированного бедра и его ветви (большеберцовый и поверхностный малоберцовый нер­вы) на голени. После альдегидно-осмиевой фиксации кусочки нервов измельчали, заливали в эпоксидные смолы. Поперечные полутонкие (толщиной 1 мкм) срезы нер­вов дистальнее уровня швов и соответствующих участков интактных нервов получали на ультратомах (LKB, Швеция) и окрашивали по Уикли.

Микроскопию срезов проводили на больших исследовательских микроскопах («Opton», Германия), оцифровку и анализ изображений - на аппаратно-программном комплексе ДиаМорф (Москва). С наиболее репрезентативного среза дистального отрезка седалищного нерва оцифровывали от 30 до 80 полей зрения (ув. 1250), таким образом от каждой собаки получали изображения от 300 до 500 миелинизированных нервных волокон. Измеряли их диаметр (Dmf), толщину аксонов (Dax), миелиновой оболочки (Lmyel), аксоно-миелиновое отношение (число G) - частное от деления диаметра аксона на диаметр волокна, рассчитывали средние размерные показатели. Для двойного контроля результатов морфометрировали нервы 3 интактных собак. Строили частотные гистограммы распределения миелинизированных волокон по диаметру (шаг 1 мкм) по данным от каждого животного и усредненные гистограммы по каждой группе.

Для статистической обработки данных использовали параметры описательной статистики; гипотезы о различиях проверяли с помощью критериев Вилкоксона-Манна-Уитни, Пагуровой, Лемана-Розенблатта, значения которых получали в компьютерной программе Attestat, версия 9.3.1^[1].

Через 2,5 и 4 мес после операции поперечные срезы дистального отрезка регенерирующего нерва у животных опытной группы отличались от контроля большей численностью эндоневральных микрососудов, более крупными размерами осевых цилиндров регенерирующих миелинизирующихся нервных волокон и их более выраженной дифференцировкой. Была отмечена также более полная реиннервация пучков Ремака (безмиелиновые волокна, ответственные за ноцицепцию, температурную и тактильную чувствительность).

По данным количественного анализа, через 2,5 мес после операции статистически значимых различий между подгруппами Cer1 и Cer2 выявлено не было. Поэтому в таб­лице соответствующие данные опыта объединены в единую опытную группу - Cer1+2.

Через 4 мес после операции группа сравнения не отличалась по морфометрическим параметрам от контроля - т.е. влияния на регенерацию параневральных инъекций физиологического раствора выявлено не было. Показатели же опытной группы указывали на лучшую дифференцировку регенерирующих волокон, чем в контроле (p<0,01), причем в подгруппе Cer1 средний диаметр аксонов миелинизированных волокон был сопоставим с соответствующим показателем в интактной группе животных (см. таблицу). Кроме того, через 4 мес все средние морфометрические параметры в подгруппе Cer1 были достоверно больше, чем в подгруппе Cer2 (p<0,01).

Через 6 мес после операции были обнаружены выраженные особенности в строении проводниковой части регенерирующего нерва у животных контрольной и опытной групп. В контрольной группе значительная часть профилей миелинизированнных волокон в поперечных срезах седалищного нерва и особенно нервов голени имеет атрофические контуры (почкообразная форма либо форма трилистника). В подгруппе Cer1, помимо атрофичных проводников, регулярно встречались миелинизированные регенерирующие волокна в состоянии аксональной дегенерации либо нодального аксонального спраутинга.

В подгруппе Cer2 выявлялись также волокна с атрофичными аксонами, встречались единичные фигуры вторичной дегенерации и было увеличено представительство крупных миелинизированных волокон и выражена гипертрофия безмиелиновых и миелинобразующих шванновских клеток. При количественном анализе было установлено, что в подгруппе Cer1 размерные морфометрические параметры регенерирующих миелинизированных волокон по сравнению с предыдущим сроком снижаются и приближаются к показателям контрольной группы (см. таблицу, рис. 1 и 2).

Через 12 мес после операции в контрольной группе и подгруппе Cer1 средние морфометрические параметры миелинизированных волокон не имели достоверных отклонений, но не достигали значений интактного нерва; распределение регенерирующих миелинизированных волокон по диаметру оставалось унимодальным. В подгруппе Cer2 шванновские клетки имели обычный вид, средний Dmf по-прежнему превышал соответствующий параметр интактного нерва, а средняя Lmyel недостоверно снижалась (p>0,05) по сравнению с предыдущим сроком. Вариативность и распределение по Dmf не имели статистически значимых отличий от интактного нерва.

Известно, что восстановление Dmf регенерирующих волокон длится многие месяцы и годы [18]. Это пред­определяет недостаточную скорость проведения по ним нервных импульсов и в итоге приводит к необратимым изменениям органов-мишеней. В большинстве ранее выполненных экспериментов с целью разработки способов оптимизации нейрорегенерации авторы ограничивались оценкой ближайших результатов. Единичные публикации отдаленных результатов ставят под сомнение возможность полноценного структурного восстановления диамет­ров крупных миелинизированных волокон, ответственных за проведение двигательных и проприоцептивных импульсов. Например, по данным J. Schröder [21], через 12 мес после восстановительной операции на седалищном нерве собак средний Dmf составил 79%, а Lmyel - всего 57% нормы; через 24 мес автор не выявил достоверного увеличения параметров. В нашем исследовании в контрольной группе (без применения терапевтических воздействий на регенераторный процесс за тот же срок) Dax составил 78,9% нормы, Lmyel - 61,6%.

Мы предположили, что применение церебролизина позволит повысить регенераторные потенции аксотомированных нейронов с учетом известных данных о молекулярно-биологических механизмах действия препарата [6]. Примененная нами методика параневрального введения церебролизина основана на данных о повышении пиноцитозной активности периневральных клеток в составе многослойного периневрия крупных нервов при травмах и хирургических операциях у экспериментальных животных [5]. Она может рассматриваться в качестве аналога методики Скворцова-Осипенко [4]. Последняя применяется в составе комплексной терапии нейропатий [6] и включает несколько курсов из 5 инъекций с длительными перерывами. Для разработки методики аддитивной терапии при полных анатомических перерывах нервов представлялось целесообразным изучить результаты одного длительного курса из 20 инъекций на стандартной биологической модели.

Выполненные нами эксперименты на животных позволили выявить влияние церебролизина на гистологические особенности регенерации нерва при разных схемах применения. В ранние сроки после операции выявлено выраженное стимулирующее влияние препарата на реиннервацию пучков Ремака, радиальный рост и дифференцировку миелинизирующихся регенерирующих волокон при обеих изученных схемах. Однако во втором полугодии после операции в подгруппе со стандартной схемой применения препарата (5 инъекций в неделю) были отмечены отрицательная динамика морфометрических параметров и явления вторичной дегенерации регенерирующих волокон, что свидетельствовало о большем истощении компенсаторно-приспособительных возможностей нейронов и миелинобразующих шванновских клеток, чем в контроле.

При пролонгированной схеме применения (3 инъекции в неделю) уже через 6 мес после операции восстанавливались вариативность и свойственное интактному нер­ву бимодальное распределение миелинизированных нервных волокон по диаметру; поддержание нормо- и гипертрофического статуса регенерировавших миелинизированных волокон наблюдалось и через 12 мес после операции - т.е. через 10,5 мес после окончания курса параневральных инъекций церебролизина, причем средняя толщина миелиновой оболочки регенерировавших нервных волокон достигала 79,5% нормы (на 17,9% больше, чем в контроле).

Данные гистологического исследования свидетельствуют о стимулирующем влиянии препарата не только на регенераторный рост и дифференцировку осевых цилиндров нервных волокон, но и васкуляризацию дистального отрезка регенерирующего нерва, а также трофическое состояние миелинобразующих шванновских клеток. Последнее дает основание расширить область применения препарата: он может оказаться эффективным в лечении особых видов повреждений нервов, вызывающих массивную гибель периферической глии в результате острого ишемического некроза [10].

Представляется важным проведение опытов с пролонгированной схемой введения препарата (курс из 20 инъекций по 3 инъекции в неделю) при перерезке нервов в клинике.