Катехол-O-метилтрансфераза (КОМТ) — фермент, катализирующий О-метилирование катехоламинов и их гидроксилированных метаболитов, синтезируется многими типами клеток периферической и центральной нервной системы [16]. В мозге КОМТ экспрессируется в пирамидных нейронах префронтальной коры (ПФК) и гиппокампе, где принимает участие в процессах элиминации из синаптической щели дофамина (ДА) [17]. Основное значение для метаболизма ДА имеет его обратный захват в пресинаптические окончания, осуществляемый транспортером ДА, с последующим его разрушением ферментом моноаминоксидазой. Однако в областях мозга с низким уровнем экспрессии транспортера ДА, таких как ПФК, ведущую роль в инактивации играет постсинаптический транспортер норадреналина, сопряженный в работе с КОМТ [18].

Интерес к КОМТ возник в 90-е годы прошлого века после открытия функционального полиморфизма в кодоне 158 (Val158Met), определяющего разную активность фермента [13]. Вариации нуклеотидов в экзоне 3 гена КОМТ (gtg и atg) приводят к замене аминокислот (валин на метионин) при синтезе белка КОМТ. Один из полиморфных аллелей — H (Val, валин) сопряжен с нормальным уровнем активности фермента, второй — L (Met, метионин) вызывает 3—4-кратное его снижение [12]. Наличие подобной генетической изменчивости — это редкий случай, когда возможно выделить индивидуальные различия в функционировании отдельного фермента, важного для регуляции нейромедиаторных процессов. За прошедшее время было проведено несколько тысяч исследований, в которых изучалось влияние данной генетической вариации на болевую чувствительность, когнитивные способности, тревожность и подверженность наркотической зависимости [1—4, 8, 20]. Все эти процессы связаны с метаболизмом ДА в ЦНС, хотя четкой корреляции между активностью КОМТ и клиническими фенотипами испытуемых выявить не удалось [14, 15]. Однако было показано, что у кокаиновых наркоманов из популяции афроамериканцев чаще встречается повышенная экспрессия аллеля L по сравнению со здоровой контрольной группой той же популяции, несущей аллель Н и имеющей нормальный уровень КОМТ (35 и 27% соответственно) [15,1].

Генетически модифицированные животные с направленной мутацией по выбранному гену представляют исключительный интерес для выяснения роли КОМТ, в частности в функционировании мезокортиколимбической системы «награды» мозга. Центральным звеном этой системы, играющей ведущую роль в механизмах формирования и поддержания наркотической зависимости, являются дофаминергические проекции из вентральной тегментальной области мозга в стриатум. Было показано, что животные c выключенным геном КОМТ имеют нормальные двигательные функции, однако демонстрируют некоторые отклонения когнитивного функционирования, агрессивности, тревожности и чувствительности к стрессу и боли [19]. В ряде экспериментов с использованием методов in vivo микродиализа и хронамперометрии было установлено, что недостаток данного фермента у мышей существенно не влияет на уровень катехоламинов в стриатуме [22]. Однако у этих животных наблюдалось двукратное увеличение времени элиминации ДА в ПФК и значительное повышение концентрации его метаболита дигидроксифенилуксусной кислоты по сравнению с мышами дикого типа, свидетельствующее о существенной роли КОМТ в гомеостазе ДА в этой области мозга [10].

Принимая во внимание важную роль КОMT в метаболизме катехоламинов ПФК и наличие нисходящей функциональной связи между ПФК и стриатумом [21], было выдвинуто предположение о влиянии уровня активности КОМТ на чувствительность к подкрепляющему действию кокаина. Кокаин обладает выраженными подкрепляющими свойствами благодаря способности увеличивать концентрацию ДА в ЦНС путем быстрого обратимого блокирования транспортера ДА, обеспечивающего обратный захват и дальнейшее разрушение катехоламина. Низкая активность КОМТ увеличивает продолжительность действия и эффективность ДА в синапсах ПФК, тем самым вызывая когнитивные, эмоциональные и поведенческие отклонения, обусловливающие предрасположенность к формированию зависимости от кокаина [20].

Цель исследования — изучение влияния дефицита КOMT на чувствительность к подкрепляющему действию кокаина.

Исследование было выполнено на 15 самцах мышей линии С57BL/6J с выключенным геном КОМТ (KO) [9] и 15 мышах дикого типа (WT) той же линии, полученных из питомника Университета Хельсинки (Финляндия). Животных содержали в индивидуальных клетках стандарта ТII («Velaz», Чешская Республика) с подстилом TierWohl («J.Rettenmaier&Sohne GmbH&Co», Германия) в условиях контролируемой влажности (40—70%) и температуры (21±1°С) воздуха. Животные имели неограниченный доступ к очищенной воде (фильтр «Аквафор», Санкт-Петербург) и полнорационному комбикорму (ООО «Лабораторснаб», Москва). Эксперименты проводили во время светлой фазы поддерживаемого фоторежима (08.00—20.00). Все животные были приучены к рукам экспериментатора до проведения экспериментов.

Сессии ВВС проводили в стандартных экспериментальных камерах размером 18x18x29 см, помещенных в звуко- и светоизолирующие боксы, оборудованные вентиляторами для обеспечения воздухообмена. Экспериментальные камеры были снабжены двумя отверстиями для выглядываний и инфузионной системой, точность дозирования которой обеспечивали использованием насосов с шаговым двигателем («RITEC», Санкт-Петербург). Управление насосами и регистрацию выглядываний осуществляли при помощи IBM-совместимого компьютера, оснащенного аппаратными и программными средствами («Med Associates», Inc., США) с расширениями, написанными на языках Medstate Notation и Delphi.

Для наркотизации животных была использована смесь кетамина (65 мг/кг; ФГУП «Эндокринный завод», Москва) и ксилазина (10 мг/кг; «Interchemie», Нидерланды). Внутривенные катетеры были имплантированы в яремную вену по методике, описанной ранее [6]. После операции животных содержали в помещении с теплым воздухом (24°С) в течение 12 ч. Имплантированные катетеры промывали один раз в сутки растворами, содержащими антибиотик цефазолин (1% — 0,03 мл; «Синтез», Курган) и гепарин (50 МЕ/мл — 0,03 мл; «ICN Galenika», Сербия). Проходимость катетеров проверяли еженедельно или при появлении изменений в поведении животного с помощью разового введения через катетер кетамина (30 мг/кг). Признаком проходимости являлась мгновенная седация животного. Все мыши с отсроченной/отсутствующей реакцией были исключены из исследования и последующего анализа данных.

Через 3 дня после операции проводили ежедневные сессии внутривенного самовведения кокаина. Выглядывания в одно из отверстий камеры — «активное» (правое для половины животных и левое для остальных) — инициировали внутривенное введение кокаина (20 мкл, 3 с) и выключение света в камере на 30 с (тайм-аут). В течение этого периода выглядывания в активное отверстие регистрировали, но это не приводило к инфузии кокаина. Выглядывания в другое отверстие («неактивное») на протяжении всей экспериментальной сессии записывались программой, но не имели никаких последствий.

Для расчета точной дозы вещества животных взвешивали перед каждой экспериментальной сессией. Внутривенное самовведение кокаина (0,3 мг/кг на инфузию) в течение первых 5 дней проводили в режиме фиксированного соотношения 1 (ФС1), при котором внутривенными инфузиями подкрепляли каждое выглядывание в «активное» отверстие. Далее в соответствии с режимом ФС3 инфузия кокаина сопровождала каждое третье выглядывание. Для предотвращения причинения вреда здоровью животных вследствие употребления высоких доз психостимулятора максимальную дозу вводимого кокаина ограничивали 30 мг/кг за сессию. Экспериментальные сессии завершали по истечении 3 ч или по достижении критерия максимально возможной дозы в зависимости от того, что происходило раньше.

После выработки устойчивого самовведения кокаина (0,3 мг/кг на инфузию) в режиме ФС3 мыши были переведены на режим возрастающего соотношения (ВС). Критерием устойчивости поведения являлось поддержание самовведения на уровне 70% предпочтения «активного» отверстия с общим количеством инфузий не менее 10 в течение каждой из двух последовательных сессий. В ходе одной сессии ВС количество выглядываний в активное отверстие, необходимое для получения одной инфузии, пошагово увеличивали в соответствии с формулой ВС=Сшаг-1+(шаг/2), определяющей последовательность: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 25, 30 и т.д. [7]. После этого этапа животные были разделены на две группы. Для одной из них доза кокаина была снижена до 0,1 мг/кг на инфузию в течение двух последовательных сессий в режиме ФС3 и одной — в режиме ВС, после чего в соответствии с той же схемой дозу кокаина увеличивали до 1 мг/кг на инфузию. Вторая группа мышей получала инфузии кокаина согласно той же схеме, но порядок предъявления доз был обратным. Далее дозы кокаина были изменены на 0,03 и 3 мг/кг на инфузию (рис. 1).

Рис 1. Схема эксперимента внутривенного самовведения кокаина у мышей.

Примечание. По оси абсцисс — дни эксперимента, по оси ординат — доза кокаина (мг/кг/инфузия).

Результаты экспериментов обрабатывали с помощью пакета статистических программ SPSS (версия 16, США). Статистическую значимость оценивали с помощью многофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Межгрупповые сравнения (тест Бонферрони) проводили только при условии выявления значимого результата процедурой дисперсионного анализа. Зависимыми переменными были количество инфузий и выглядываний в «активное» и «неактивное» отверстия для ФС и ВС сессий. Независимыми — доза кокаина (5 уровней: 0,03, 0,1, 0,3, 1 и 3 мг/кг на инфузию) и тип животного (2 уровня: WT и KO).

Как указывалось выше, в данной работе чувствительность к действию кокаина оценивали с использованием метода внутривенного самовведения. Согласно классическому определению феномена подкрепления, позитивно-подкрепляющие стимулы характеризуются способностью увеличивать вероятность повторения поведенческой реакции, которая предшествует их предъявлению [5]. Реакция самовведения кокаина в дозе 0,3 мг/кг/инфузия была успешно выработана у мышей как КО, так и WT. Более того, в диапазоне исследуемых доз (0,03, 0,1, 0,3, 1 и 3 мг/кг на инфузию) сопоставимый уровень самовведения кокаина наблюдали у КО и WT мышей в каждом из режимов подкрепления. Так, в режиме подкрепления ФС3 (рис. 2)

Рис. 2. Суммарное количество инфузий кокаина (М±m), полученных KO и WT мышами в ходе экспериментальных сессий в режиме подкрепления ФС3.

]]>

Примечание. Здесь и на рис. 3, 5, 6: по оси абсцисс — доза кокаина (мг/кг/инфузия), по оси ординат — количество инфузий.

Рис. 3. Суммарное количество инфузий кокаина (М±m), полученных KO и WT мышами в ходе экспериментальных сессий в режиме подкрепления ВС.

]]>

Рис. 4. Финальные значения соотношения (ось ординат) количества выглядываний (М±m), необходимых для получения разовой инфузии кокаина, достигнутые KO и WT мышами в ходе экспериментальных сессий в режиме подкрепления ВС.

]]>

Максимальное количество инфузий кокаина, получаемых за одну экспериментальную сессию, было ограничено критерием предельно допустимой дозы (30 мг/кг), что могло повлиять на «оперантный выход» и привести к искажению получаемых в рассматриваемой методике данных. В связи с этим были проанализированы первые 30 мин всех экспериментальных сессий, дающих представление об уровне чувствительности животных к подкрепляющему действию кокаина (рис. 5, 6).

Рис. 5. Среднее количество инфузий кокаина, полученных KO и WT мышами в ходе первых 30 мин экспериментальных сессий в режиме подкрепления ФС3.

]]>

Рис. 6. Среднее количество инфузий кокаина, полученных KO и WT мышами в ходе первых 30 мин экспериментальных сессий в режиме подкрепления ВС.

]]>

Результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод, что индивидуальные различия в активности КОМТ не влияют на чувствительность мышей к первично-подкрепляющему действию кокаина. Сравнить полученные результаты с работами других авторов не представляется возможным, поскольку изучение чувствительности мышей с выключенным геном КОМТ к действию психоактивных веществ с использованием метода внутривенного самовведения ранее не проводили. При сравнительной оценке эффектов амфетамина на двигательную активность самцов и самок мышей (КО и WT) было выявлено, что только самцы с дефицитом КОМТ менее чувствительны к угнетающему действию вещества в дозе 10 мг/кг [11]. В дозах 1 и 5 мг/кг, стимулирующих двигательную активность животных, амфетамин оказывал одинаковое действие на мышей обоих типов.

Таким образом, полученные экспериментальные данные в сочетании с противоречивыми результатами клинических исследований роли Val158Met полиморфизма в предрасположенности к развитию наркотической зависимости [14] не дают оснований считать уровень экспрессии КОМТ решающим фактором для развития зависимости от кокаина.