Аниол В.А.

1. Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН; 2. ООО "Герофарм"; 3. Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН; 4. Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва

Новицкая Ю.

Бородина Т.Н.

Букреева Т.В.

Лазарева Н.А.

Моисеева Ю.В.

Онуфриев М.В.

Степаничев М.Ю.

Яковлев А.А.

Санкт-Петербургский ГБУЗ «Городская многопрофильная больница №2», Учебный переулок, 5, Санкт-Петербург, Россия, 194354

Гехт А.Б.

Кафедра неврологии и нейрохирургии лечебного факультета Российского национального исследовательского университета им. Н.И. Пирогова; специализированная клиническая (психоневрологическая) больница №8, Москва

Гранстрем О.К.

НИИ неотложной детской хирургии и травматологии, Научный центр здоровья детей РАМН, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва; ООО "Герофарм", Санкт-Петербург

Гуляева Н.В.

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва

Оценка противоэпилептических эффектов кортексина на модели судорожной активности

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2011;111(12): 68-73

Просмотров : 696

Загрузок : 13

Как цитировать

Аниол В. А., Новицкая Ю., Бородина Т. Н., Букреева Т. В., Лазарева Н. А., Моисеева Ю. В., Онуфриев М. В., Степаничев М. Ю., Яковлев А. А., Гехт А. Б., Гранстрем О. К., Гуляева Н. В. Оценка противоэпилептических эффектов кортексина на модели судорожной активности. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2011;111(12):68-73.
Aniol V A, Novitskaia Iu, Borodina T N, Bukreeva T V, Lazareva N A, Moiseeva Iu V, Onufriev M V, Stepanichev M Iu, Yakovlev A A, Gekht1 A B, Granstrem O K, Guliaeva N V. Evaluation of antiepileptic effects of cortexin in a model of convulsions. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2011;111(12):68-73.

Авторы:

Аниол В.А.

1. Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН; 2. ООО "Герофарм"; 3. Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН; 4. Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва

Все авторы (12)

Широкая распространенность эпилепсии, высокий риск развития сопутствующих судорожным припадкам неврологических и когнитивных нарушений наряду с высокой частотой фармакорезистентных форм этого заболевания делают актуальным поиск новых противоэпилептических препаратов (ПЭП), обладающих не только достаточно высоким антиэпилептическим потенциалом, но и способных повышать устойчивость тканей мозга к повреждающему действию судорожной активности (нейропротекторные свойства). В определенной мере этим требованиям отвечает препарат кортексин.

Первоначальная оценка эффективности клинического применения кортексина при эпилепсии была выполнена на кафедре неврологии Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии в 2003 г. [3]. Кортексином лечили пациентов в возрасте от 1,5 до 17 лет с диагнозом симптоматической эпилепсии. Введение кортексина в течение 10 дней позволило улучшить у детей показатели памяти и внимания; у половины леченых детей от 1,5 до 5 лет была отмечена положительная динамика психомоторного и речевого развития; ни в одном из наблюдаемых случаев кортексин не спровоцировал рецидив эпилептических приступов; не было зарегистрировано отрицательных изменений неврологического статуса и ЭЭГ, а также побочных эффектов.

Приведенные результаты оказались сходными с наблюдениями, сделанными в Институте мозга человека РАН в 2000-2010 гг. [5]. В этом исследовании было дополнительно установлено, что назначение кортексина позволило нормализовать метаболизм в соответствующих областях мозга. Эффективность кортексина при эпилепсии изучали также В.Н. Цыган и соавт. [7], которые установили, что включение кортексина в схему стандартной терапии эпилепсии приводит к исчезновению пароксизмов на протяжении года и улучшению показателей ЭЭГ у 60-80% пациентов. Полученные данные потребовали детализации и верификации в дальнейших работах [8].

Известно, что кортексин представляет собой комплекс водорастворимых полипептидов. Принято считать, что, проникая через гематоэнцефалический барьер, он оказывает ноотропный, нейропротекторный и антиоксидантный эффекты. Механизм действия кортексина связывает активацией пептидов нейронов и нейротрофических факторов мозга, оптимизацией баланса метаболизма возбуждающих и тормозных аминокислот, дофамина, серотонина, ГАМКергическим воздействием, предотвращением образования свободных радикалов [4, 6]. Эти эффекты, а также способность пептидных препаратов модулировать нейрональную пластичность и нормализовать метаболизм поврежденных тканей, дают основания предполагать, что и дальнейшее изучение их терапевтического действия может быть перспективным направлением в области лечения эпилепсии.

Целью данной работы стало изучение особенностей противосудорожного действия с использованием модели эпилепсии. В качестве основной модели выбрана одна из наиболее удобных и часто используемых в настоящее время моделей эпилептогенеза - пентилентетразоловый киндлинг (ПТЗК). Суть процедуры киндлинга (англ. kindling - раскачивание) заключается в том, что электрическая, химическая (в данном случае - введение пентилентетразола, антагониста ГАМКА-рецепторов) или иная стимуляция мозга изначально подпороговой интенсивности после нескольких применений вызывает прогрессивно нарастающую по силе судорожную активность, которая выражается в появлении эпилептической активности на ЭЭГ и моторных судорогах. Процедура киндлинга делает отделы мозга животного патологически восприимчивыми к эпилептогенным стимулам, приводя к развитию судорожной активности, т.е. изначально здоровые животные после развития киндлинга демонстрируют спонтанные повторные судороги [11, 12]. ПТЗК успешно используют для изучения механизмов развития эпилепсии, в частности височной, у человека, поскольку ПТЗК во многом воспроизводит характер ЭЭГ, мышечных судорог, структурно-функциональных нейрональных перестроек и обладает определенно предиктивной валидностью в отношении влияния антиэпилептических веществ. Он является общепринятой моделью для скрининга лекарственных средств для лечения эпилепсии [15].

Материал и методы

В работе были использованы 180 самцов крыс линии Вистар, полученных из питомника «Столбовая» РАН. Средняя масса животных на начало эксперимента была 150-200 г. В течение всего эксперимента животных содержали в условиях вивария при искусственном световом режиме и постоянной температуре. Эксперименты проводили в первой половине светового дня.

Кортексин растворяли в изотоническом растворе NaCl в концентрациях 0,015, 0,15 или 1,0 мг/мл и вводили внутрибрюшинно из расчета 1 мл/кг. В качестве препаратов позитивного и негативного контроля использовали диазепам (0,2 мг/кг) в изотоническом растворе NaCl и чистый изотонический раствор NaCl соответственно. Кроме того, кортексин в дозе 0,15 мг/мл сорбировали на наночастицах и вводили интраназально. Для повышения эффективности доставки кортексина в мозг использовали микроконтейнеры на основе карбоната кальция. Ранее подобная система была успешно использована для доставки в мозг центрального анестетика лоперамида [2]. Кортексин включали в неорганическую матрицу микрочастиц с помощью его соосаждения с СаСО3 из смеси растворов карбоната натрия и хлорида кальция [20]. Количество функционального вещества в частицах определяли спектрофотометрически.

Судорожную активность вызывали внутрибрюшинным введением пептилентетразола (ПТЗ) (фирмы «Sigma», США) в изотоническом растворе NaCl в дозе 37,5 мг/кг (при хроническом введении) или 70 мг/кг (при остром введении). В пробном эксперименте, проведенном до начала данного исследования, при однократном применении ПТЗ в этих дозах соответственно не вызывал конвульсивных судорог и вызывал генерализованную клонико-тоническую судорожную активность, не приводящую к смерти животного.

Влияние кортексина на развитие судорожной активности исследовали в соответствии с 3 схемами экспериментов. В каждой из них было использовано по 6 групп животных (по 10 в каждой группе), получавших кортексин интраперитонеально в дозах 0,015, 0,15 или 1,0 мг/кг, кортексин, сорбированный на наночастицах, в дозе 0,15 мг/кг интраназально, диазепам или изотонический раствор NaCl интраперитонеально. Животные распределялись между группами случайным образом.

Схема эксперимента 1 - введение кортексина до провокации однократных генерализованных клинико-тонических судорог. В этом случае кортексин и контрольные вещества вводили ежедневно в течение 10 дней; на 10-й день через 1 ч после введения препаратов животных использовали для моделирования эпилептического статуса однократной внутрибрюшинной инъекцией ПТЗ в дозе 70 мг/кг (рис. 1, а).

Рисунок 1. Схема эксперимента. а - эксперимент 1, введение кортексина до провокации однократных генерализованных клонико-тонических судорог; б - эксперимент 2, введение кортексина животным со сформированным ПТЗК; в - эксперимент 3, введение кортексина животным перед киндлингом и на фоне его выработки.

Схема эксперимента 2 - введение кортексина животным со сформулированным ПТЗ. Животным вводили ПТЗ в дозе 37,5 мг/кг 3 раза в неделю, всего 13 инъекций, после чего в течение 10 дней ежедневно вводили кортексин и контрольные вещества. На 10-й день через 1 ч после введения препаратов осуществляли проверку сохранности киндлинга провоцирующей инъекцией ПТЗ в дозе 37,5 мг/кг (см. рис. 1, б).

Схема эксперимента 3 - введение кортексина перед киндлингом и на фоне его выработки. Кортексин и контрольные вещества вводили ежедневно в течение 10 дней, после чего (на 10-й день) начинали выработку киндлинга. Для этого 3 раза в неделю животным вводили ПТЗ в дозе 37,5 мг/кг, всего 13 инъекций. За 1 ч до каждой инъекции ПТЗ животные также получали кортексин или контрольные препараты. После окончания курса инъекций ПТЗ животным предоставляли период отдыха сроком 10 сут, после чего (на 10-й день) осуществляли проверку сохранности киндлинга провоцирующей инъекцией ПТЗ в дозе 37,5 мг/кг (см. рис. 1, в).

Оценку судорожной активности проводили в течение 20 мин после введения ПТЗ по шкале H. Franke и H. Kittner [10], в которой предусмотрены следующие стадии реакции: стадия 0 - отсутствие реакции; стадия 1 - лицевые автоматизмы, подергивание ушей и вибрисс; стадия 2 - конвульсивные волны, распространяющиеся вдоль оси туловища; стадия 3 - миоклонические судороги со вставанием; стадия 4 - клонико-тонические судороги с потерей позы; стадия 5 - генерализованная тоническая экстензия.

Проводилась также регистрация времени от введения ПТЗ до развития первых клонических судорог (латентный период).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного пакета Statistica 7.0 (StatSoft, США). Достоверность отличий между группами оценивали с применением непараметрического критерия Манна-Уитни, достоверность отличий между разными временны`ми точками внутри одной группы оценивали при помощи парного критерия Вилкоксона. Развитие киндлинга в разных группах сравнивали при помощи дисперсионного анализа для последовательных измерений (repeated measures ANOVA) с последующим сравнением групп между собой при помощи критерия Ньюмена-Кейлса. Для анализа соотношений «доза-эффект» использовали корреляционный анализ по методу Спирмена. Критерий достоверности во всех случаях был установлен на уровне p<0,05. Данные на рисунках представлены в виде M±S.E.M.

Результаты

Эксперимент 1. При моделировании однократных генерализованных клонико-тонических судорог было обнаружено, что кортексин в большинстве групп не влиял на выраженность судорожной активности, т.е при введении перед моделированием эпилептического статуса кортексин не демонстрировал прямого противосудорожного эффекта.

Эксперимент 2. В ходе выработки ПТЗК сила судорожной активности увеличилась с 1,02±0,02 балла после первой инъекции ПТЗ до 2,60±0,08 балла после 13-й инъекции ПТЗ. После окончания выработки ПТЗК животным в течение 10 дней вводили кортексин или контрольные вещества, после чего на 10-й день давали еще одну, провоцирующую инъекцию ПТЗ в той же дозе, которую использовали при выработке киндлинга (рис. 2).

Рисунок 2. Сравнение силы судорог (а) и латентного периода судорожной активности (б) крыс с выработанным ПТЗК в ответ на инъекцию ПТЗ (37,5 мг/кг) до и по окончании 10 дней введения кортексина или контрольных веществ. * - отличие от контрольной группы (p<0,05; парный тест Вилкоксона).
Было обнаружено, что ни в одной из групп введение кортексина или контрольных веществ в течение 10 дней не оказывало влияния на силу судорог, вызванных провоцирующим введением ПТЗ (p>0,1; парный тест Вилкоксона). Тем не менее животные после курсового введения кортексина в дозе 1,0 мг/кг в течение 10 дней демонстрировали более длительный латентный период развития конвульсивных судорог, чем до введения кортексина (p<0,05; парный тест Вилкоксона). Таким образом, при введении животным с уже сформированным ПТЗК кортексин в дозе 1,0 мг/кг не влиял на силу судорожной активности в ответ на провоцирующую инъекцию ПТЗ, хотя и отдалял время начала клонических судорог.

Эксперимент 3. В данном эксперименте оценивали влияние кортексина на процесс формирования ПТЗК при введении препарата перед началом выработки киндлинга, а также в течение всего времени его развития. Сила судорог у животных, получавших кортексин до и во время выработки ПТЗК, не отличалась от контрольной группы в течение всего периода выработки киндлинга (рис. 3).

Рисунок 3. Сила судорог животных, получавших кортексин или диазепам до и во время выработки ПТЗК, по сравнению с животными контрольной группы. Сплошная линия - контрольная группа. Пунктирная линия - группы животных, получавших кортексин в дозе 0,015 мг/кг (а), 0,15 мг/кг (б), 1,0 мг/кг (в), кортексин в комплексе с наночастицами (г) и диазепам в дозе 0,2 мг/кг (д). * - отличие от контрольной группы (p<0,05; тест Ньюмена-Кейлса). Группа животных, получавших диазепам, отличалась от контрольной группы на всем протяжении выработки ПТЗК: F(1,17)=5,52; p=0,03.
Тем не менее после 10-дневного периода отдыха животные, прежде получавшие кортексин в дозе 1,0 мг/кг, демонстрировали достоверно более слабые судороги в ответ на провоцирующее введение ПТЗ по сравнению с контрольными животными. Тенденция к такому снижению силы судорог при провокации присутствовала и в группе, получавшей меньшую дозу кортексина (0,15 мг/кг). Однако животные, получавшие минимальную исследовавшуюся дозу кортексина (0,015 мг/кг), не отличались от контрольной группы при провокации, как и животные, получавшие кортексин в комплексе с наночастицами.

Поскольку в ходе проведенных экспериментов были получены данные, указывающие на возможное наличие зависимости между дозой кортексина и выраженностью судорог при провокации, был проведен корреляционный анализ величин силы и латентного периода судорожной активности при провокации с применявшейся дозой кортексина. Было обнаружено, что с дозой кортексина при введении до и во время выработки ПТЗК обратно коррелировала выраженность судорожной активности при последующей провокации (коэффициент корреляции Спирмена r=–0,41; p<0,05) и положительно коррелировала длительность латентного периода при провокации (коэффициент корреляции Спирмена r=0,6; p<0,05). Таким образом, увеличение дозы кортексина (в диапазоне 0,015-1,0 мг/кг), применявшегося до и во время выработки ПТЗК, приводило к ослаблению судорог и замедлению их развития при последующей провокации. При введении кортексина после выработки ПТЗК его доза не коррелировала с длительностью латентного периода и выраженностью судорожной активности при провокации. Результаты сравнения эффектов различных доз кортексина на эти показатели в двух экспериментах представлены на рис. 4.

Рисунок 4. Сравнение силы судорог (а) и латентного периода судорожной активности (б) у крыс, получавших кортексин до и во время выработки ПТЗК (темные столбики), и у крыс, получавших кортексин после выработки ПТЗК (светлые столбики). Значения приведены к показателям контрольной группы в каждом эксперименте, принятым за 100%.

Обсуждение

Представленные результаты свидетельствуют о способности кортексина влиять на латентность и степень выраженности судорог при моделировании хронической судорожной активности с использованием ПТЗ. Иными словами, показана дозозависимая противоэпилептическая активность кортексина.

При этом длительное (10 дней) применение кортексина перед введением высокой однократной дозы ПТЗ (70 мг/кг) не влияло на судорожную активность. Это свидетельствует об отсутствии у кортексина прямой противосудорожной активности.

Выше уже говорилось о том, что часто при моделировании эпилептогенеза используется феномен киндлинга [16, 22]. Хроническое введение подпороговой дозы ПТЗ сопровождается развитием киндлинга, являющегося моделью эпилептогенеза с доказанной предсказательной ценностью в отношении фармакологических средств с противоэпилептической активностью. ПТЗК сопровождается не только гибелью нейронов, но и синаптической реорганизацией, аксональным спраутингом (англ. sprout - пускать ростки), т.е. с образованием новых ветвей аксонов нервных волокон, изменениями нейрогенеза в гранулярном слое зубчатой извилины гиппокампа, глиозом, изменением экспрессии генов в нейронах и астроцитах. Эти изменения обусловливают активацию нервных сетей и усиление их ответа на каждое последующее введение ПТЗ. Кроме того, развитие судорожной активности при ПТЗК сопровождается нарушениями обучения и памяти у животных и развитием нейродегенеративных процессов, локализованных преимущественно в гиппокампе [10, 17, 18, 22], что позволяет считать ПТЗК наиболее адекватной моделью височной эпилепсии у человека [15, 19].

При моделировании хронической судорожной активности с помощью ПТЗ наиболее выраженный антиэпилептический эффект кортексина отмечался при его применении до начала и во время развития ПТЗК, при этом он носил «отставленный» характер, проявляясь через 10 дней после окончания выработки киндлинга и введения кортексина. Это дает основание полагать, что механизм действия кортексина связан с долговременными изменениями нейрональной пластичности. Последняя проявляется в перестройках нейронных сетей, преобразованием глии с пролиферацией клеток, нейро- и ангиогенезом. На молекулярном уровне речь идет об изменениях экспрессии генов, уровня кальция в ткани мозга, функции ионных каналов и рецепторов, а также метаболизма с развитием сигнальных каскадов.

Эпилепсию вообще можно рассматривать как пример аберрантных пластических преобразований [21]. В связи с этим можно привести высказывание Y. Ben-Ari [8]: мозг при эпилепсии можно охарактеризовать «новым состоянием пластичности, при котором судороги порождают судороги». Так, при височной эпилепсии эти изменения отмечены в области зубчатой извилины.

Исследования на грызунах подтвердили, что лимбические пароксизмы приводят к гибели нейронов и активации возбуждающих синапсов, которые участвуют в развитии последующих судорог. Запускающим сигналом в данном случае является формирование новых синапсов и усиление синаптической нейротрансмиссии. Новые синапсы являются аберрантными (т.е. формируются в участках, где они отсутствуют в норме) и содержат нехарактерные рецепторы. Аберрантная форма реактивной нейрональной пластичности обеспечивает последующую генерацию судорог. Эти процессы затрагивают структуры мозга, отвечающие за выполнение интегративных и мнемонических функций, и влияют на когнитивные процессы [21].

Можно полагать, что кортексин, являясь препаратом с метаболическим механизмом действия, способен корректировать метаболизм поврежденных участков нервной ткани, тем самым способствуя восстановлению нормальной пластичности нейронов. Очень сложно провести четкую грань между нормальной пластичностью и патологическими изменениями, которые составляют так называемый континуум пластичность-патология. Впервые это понятие было сформулировано J. McEachern и C. Shaw [14]. Основываясь на представлении об общности (плейотропности) основных молекулярных механизмов, необходимых для нормального функционирования нейрона и принимающих участие в его повреждении и гибели, авторы пришли к выводу, что в рамках этого континуума могут быть рассмотрены все основные проявления эпилепсии - от нормального осуществления когнитивных функций до нейродегенерации мозга и судорожной активности. Другими словами, на молекулярном уровне не происходят заведомо патологические реакции: все биохимические процессы реализуются как в нормальном состоянии, так и при патологии. Патологические изменения развиваются в результате сбоя «нормальных» механизмов и заключаются в том, что изначально нормальные реакции в таком случае осуществляются в иной степени, в иной период, в иных клетках, клеточных или внеклеточных компартментах, с иным субстратом (ферменты) [1]. Учитывая, что механизм действия кортексина включает оптимизацию баланса метаболизма возбуждающих и тормозных аминокислот, дофамина, серотонина и ГАМК, предотвращение образования свободных радикалов, представляется, что введение кортексина создает необходимые условия для нормализации патологически выраженной пластичности нервной системы и, таким образом, оказывает долговременный антиэпилептический эффект.

Проведенные эксперименты подтверждают возможность и оправданность клинического применения кортексина у пациентов с когнитивными эпилептическими дезинтеграциями в стадии клинико-электроэнцефалографической ремиссии. Материалы данного исследования подтверждают обоснованность клинического применения кортексина в терапии данной патологии головного мозга.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail