В 1975-1987 гг. в Журнале неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова [1, 3, 7, 18], а также в журналах «Архив патологии» [13, 15], «Вопросы вирусологии» [2, 4, 5] и «Soc Med Rev E Virol» [8] были представлены результаты клинико-эпидемиологических, морфологических и лабораторно-экспериментальных исследований прогрессирующей спинальной амиотрофии, названной сначала по наименованию населенного пункта, где впервые было выявлено заболевание - болезнь Миотча, а впоследствии на основании локализации патологического процесса преимущественно в передних рогах спинного и белом веществе головного мозга, получившей название амиотрофический лейкоспонгиоз (АЛ).

В течение 1957-1985 гг. в республике Беларусь было зарегистрировано 24 семейно-групповых и спорадических случаев заболевания АЛ [8].

Патогномоничным признаком заболевания было постепенное и неуклонное прогрессирование вялых парезов мышц конечностей и туловища без атрофий с неизбежным летальным исходом. Ряд других морфологических особенностей АЛ (избирательность поражения передних рогов спинного мозга, своеобразное изменение белого вещества, напоминающее «status spongiosus» при сохранности миелиновых волокон в боковых и передних столбах спинного мозга) свидетельствовал о своеобразии заболевания и отличал от других клинически сходных спинальных амиотрофий: полиомиелитического варианта бокового амиотрофического склероза (БАС), подострого переднего и хронического полиомиелита и т.п. Избирательность поражения мотонейронов преимущественно грудных сегментов спинного мозга, неуклонная прогредиентность с летальным исходом в течение 1-3 лет при спинальных расстройствах дыхания, дегенеративные изменения ЦНС и прежде всего спонгиоз белого вещества головного мозга послужили основанием для отнесения заболевания к группе прионных инфекций.

Инфекционная природа АЛ была подтверждена воспроизведением заболевания на модели белкообразных обезьян и морских свинок [2, 5, 12]. В терминальной стадии у животных развивались вялые парезы, а затем параличи задних конечностей, которые постепенно распространялись на мышцы грудной клетки с нарушениями дыхания спинального типа. При гистологических исследованиях ЦНС лабораторных животных отмечено выпадение мотонейронов в передних рогах спинного мозга и спонгиозное состояние белого вещества. При культивировании клеток мозга выделен инфекционный агент, который по своим физико-химическим свойствам был отнесен к группе неклассических вирусов - прионов [4, 5].

Несмотря на установление трансмиссивности заболевания [2, 6, 12], вопрос о прионной природе АЛ оставался спорным. В.А. Зуев, И.А. Завалишин и В.М. Ройхель - авторы монографии «Прионные инфекции человека и животных» [9] не сочли возможным включить АЛ в их число. Группа американских исследователей [20], проведя генетический анализ 12 семейно-групповых случаев АЛ, отнесли заболевание к варианту семейного АБС (субтип A4V), изредка встречаемого у жителей Северной Америки. Однако наличие мутации D101N в экзоне 4 гена S0D1 при наследственной форме АЛ не исключает вероятности наличия у этих больных прионной инфекции. Так, в монографии В.И. Покровского и соавт. [14] АЛ был отнесен к инфекционным заболеваниям из группы подострых спонгиозных энцефалопатий. В зарубежной литературе также встречаются немногочисленные ссылки, относящие АЛ к инфекционным заболеваниям прионной этиологии. Тем не менее до сих пор в международную классификацию прионных болезней человека АЛ не включен [24].

Цель настоящей публикации - представление новых клинико-морфологических данных и результатов экспериментальных исследований аутопсийных образцов головного мозга людей, умерших от АЛ, полученных при использовании современных высокочувствительных лабораторных методов исследования.

Наблюдали 2 спорадических случая АЛ.

Гистологические препараты аутопсии головного и спинного мозга готовили по общепринятой методике и окрашивали гематоксилином и эозином, крезол-виолетом по Нисслю, на миелин по Шпильмейеру и по Клювер-Баррера.

Процедуры выделения, очистки и концентрирования инфекционного агента заболевания были описаны нами ранее [17]. Концентрация белка в очищенных фракциях мозга составляла приблизительно 2 мкг/мл в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7,4.

Иммунный блоттинг проводили после ферментативной обработки аутопсийных образцов головного мозга протеиназой К (20 Ед/мл, 48°С, 1 ч) и электрофореза в 10% полиакриламидном геле, как описано [10, 11]. Перенос белков на PDVF-мембрану осуществляли при 150 В в течение 1 ч. В качестве первичных антител использовали коммерческие анти-PrP моноклональные антитела 3F4 (P1115, Sigma) в рабочем разведении 1:5000. Детекцию иммунореактивных белков проводили с использованием антимышиных антител, меченных пероксидазой хрена (А2304, Sigma), в рабочем разведении 1:3000. Для сравнения в исследованиях использовали 10% гомогенаты головного мозга и полученные на их основе очищенные фракции одного умершего больного с диагнозом болезнь Крейцфельдта-Якоба и 5 сирийских хомяков с экспериментальной инфекцией скрепи, штамм 263 К.

Электронно-микроскопические исследования проводили по ранее описанной методике [16]. Негативно окрашенные образцы просматривали в электронном микроскопе JEM-100-CХ-11 при увеличении ґ200 000.

Атомно-силовую микроскопию очищенных фракций осуществляли с использованием локально-активированной кремневой поверхности [11]. АСМ-изображения поверхности образцов получали на воздухе с помощью микроскопа Nanoscope IIIa (Veeco, США), оборудованного «J-сканером» в контактном режиме (contact mode) или в режиме прерывистого контакта (tapping mode). Исследовали очищенные фракции головного мозга (разведение 10^–4), содержащие 0,1 М ФСБ, рН 7,4, с детергентами (0,5% NP-40 и 0,5% дезоксихолат натрия).

При проведении исследований все образцы проходили одинаковые этапы пробоподготовки. Для обеспечения достоверности результатов образцы исследовали повторно еще 4 раза.

Больной Д., 44 года, ветеринар. Осенью 1979 г. отметил неловкость в пальцах правой руки, в январе 1980 г. - слабость в руках. Госпитализирован 19.08.80 г.

Неврологический статус. Функции черепных нервов (ЧН) сохранены. Движения в руках в полном объеме. Гипотрофия мышц плечевого пояса и проксимальных мышц рук, атрофия кистей по типу «когтистой лапы». Сухожильно-надкостничные рефлексы на руках с тенденцией к снижению, на ногах не нарушены. Распространенные фибрилляции в мышцах. В течение 1981 г. развился атрофический тетрапарез, преимущественно верхних конечностей. Отмечались атрофия мышц туловища, угасание глубоких рефлексов.

Повторно госпитализирован 21.10.1982 г. с жалобами на одышку, усиливавшуюся в горизонтальном положении.

Неврологический статус. Речь, жевание и глотание не изменены. Язык подвижен. Дыхание частое, поверхностное, 26 в 1 мин. Вдох сопровождается втяжением межреберных промежутков и напряжением шейных мышц. Кахексия и атрофия мышц туловища и конечностей. Сухожильно-надкостничные рефлексы не вызываются. Чувствительность не нарушена. Периодические приступы асфиксии на время исчезают после ингаляции кислорода. Скончался 28.11.1982 г. от асфиксии. Болел 36 мес.

Диагноз: амиотрофический лейкоспонгиоз, нисходящий тип с верхней параплегией.

Морфологическое исследование ЦНС. Спинной мозг атрофирован, главным образом за счет передних рогов (рис. 1, а), и не занимает полностью объема позвоночного канала.

У следующей больной заболевание развивалось по восходящему типу.

Больная К., 55 лет. Госпитализирована 15.05.06 г. с жалобами на отсутствие движений в правой ноге, слабость в левой стопе. В марте 2005 г. без видимой причины стали отмечаться небольшие боль и слабость в левой ноге. Лечение эффекта не давало. Слабость в ногах нарастала, с октября присоединилась слабость в руках, больше справа.

Неврологический статус. ЧН сохранены. Выраженная гипотрофия мышц ног, умеренная проксимально рук и мышц правой кисти. Ходить не может. Сила в проксимальных отделах рук до 3 баллов: чувствительность сохранена. Фибриллярные подергивания по задней поверхности правого бедра.

Состояние больной ухудшалось, стала нарастать общая слабость. Из-за вялого паралича конечностей не могла самостоятельно перевернуться в постели, появился осиплый голос, стала испытывать затруднения при дыхании, особенно в ночное время.

Функция ЧН по-прежнему в норме. Свободно глотает. Мягкое небо фонирует, глоточный рефлекс снижен. Тетрапарез: в ногах - плегия, выраженный парез обеих рук. Диффузная гипотония мышц конечностей. Сухожильные и периостальные рефлексы с ног и правой руки отсутствуют. Дыхание затруднено из-за слабости межреберной мускулатуры. В акте дыхания участвуют мышцы живота.

Умерла 27.05.06 г. от асфиксии спинального типа.

Патологоанатомический диагноз: амиотрофический лейкоспонгиоз, гибель мотонейронов спинного мозга, выраженный спонгиоз канатиков белого вещества за счет гибели аксонов при сохранности миелиновых оболочек.

Морфологические исследования ЦНС. В шейном утолщении спинного мозга отмечается атрофия передних рогов (рис. 2, а) с заметным уменьшением количества мотонейронов до 5-7 на поперечном срезе, спонгиозное состояние канатиков белого вещества (рис. 2, б), наиболее выраженное в боковых пирамидных путях и пучках Флексига и Говерса, при сохранности миелиновых оболочек (рис. 2, в).

В коре передней центральной извилины (поле 4) имеет место выпадение пирамидных нейронов III и V слоев. В покрышке моста признаки периваскулярного отека и свежие периваскулярные кровоизлияния. Ядра продолговатого мозга сохранены, в субэпендимальных отделах дна четвертого желудочка небольшие периваскулярные кровоизлияния. Миелин пирамид продолговатого мозга сохранен (рис. 2, г).

Таким образом, принципиально важными клинико-морфологическими признаками спорадического АЛ являются отсутствие каких-либо пирамидных знаков в начальной стадии болезни, летальный исход исключительно от нарушений дыхания спинального типа при сохранности функций ЧН, С патоморфологических позиций - это развитие спонгиоза белого вещества при сохранности миелина.

Как отмечалось, прионная природа инфекционного агента АЛ обсуждается в научной литературе уже длительное время [8, 17]. Однако фактических экспериментальных данных по его выделению, визуализации и идентификации в патологическом материале от больных до настоящего времени недостаточно. С использованием методов иммунного блоттинга, электронной и атомно-силовой микроскопии в аутопсийных образцах мозговой ткани умерших от АЛ больных нами идентифицирован патологический протеазоустойчивый прионный белок (PrP^AL).

Результаты иммунного блоттинга представлены на рис. 3.

Электрофоретический профиль белков у людей с клиническим диагнозом АЛ идентичен (см. рис. 3, дорожки 4, 5 и 6). Наличие двух полос в образцах соответствует различным гликоформам PrP^AL. Подвижность иммунореактивных белков при скрепи (дорожка 2) и при болезни Крейцфельдта-Якоба (дорожка 3) незначительно отличается от таковой при АЛ. Помимо различий в профиле подвижности гликозилированных форм белков, отмечаются различия и в степени интенсивности их окрашивания у PrP^AL, PrP^CJD и PrP^Sc (см. рис. 3).

Электронно-микроскопический анализ этих образцов методом негативного контрастирования выявил в них наличие разнообразных амилоидных филаментозных структур, аналогичных наблюдаемым ранее многими исследователями при скрепи и болезни Крейцфельдта-Якоба. По результатам иммунного блоттинга эти структуры содержали PrP27-30 и располагались на формваруглеродной подложке электронно-микроскопических сеточек в виде глобул, одиночных лежащих палочек или, реже, довольно крупных их скоплений, и скрепи-ассоциированных фибрилл. Наличие различных типов морфологических структур в анализируемой пробе коррелировало с условиями постановки эксперимента. Результаты проведенных исследований суммированы в таблице.

Глобулярные структуры имели диаметр 7-14 нм и содержали прионный белок PrP27-30. Большинство прионных палочек имело диаметр 14-16 нм и длину от 20 до 500 нм. В отдельных филаментозных структурах можно было различить субструктуры, закрученные и перекрещивающиеся друг с другом через интервалы 50-150 нм. В местах перекреста толщина структур составляла 7-8 нм. В зависимости от шага спирали (расстояния между перекрестами) у АЛ-ассоциированных подобных скрепи-ассоциированным фибриллам (САФ) филаментов можно было выделить два морфологических типа. Один из них (диаметр 10-12 нм) состоял из двух спирально закрученных протофиламентов с перекрестами через 50-60 нм. Эти АЛ-ассоциированные САФ-подобные филаменты обычно были агрегированы и выявлялись в виде пучков. Второй морфотип был представлен филаментами диаметром 14-15 нм, состоящими из двух или трех спирально закрученных протофиламентов с периодичностью витков 140-150 нм. Их толщина в местах перекреста составляла 8-10 нм. Этот морфотип был представлен одиночными филаментами. Кроме АЛ-ассоциированных САФ-подобных филаментов с перекрестами, в препаратах наблюдались одиночные или агрегированные филаментозные структуры, состоящие из параллельно расположенных протофиламентов диаметром 5 нм без периодических перекрестов. Они составляли 7-11% от общего количества наблюдавшихся структур. После ферментативной обработки их количество резко снижалось.

В АСМ-образцах, приготовленных путем адсорбции проб очищенных фракций мозга, содержащих PrP^AL, впервые выявлено наличие множественных однородных глобулярных структур, располагающихся на поверхностях кремневых подложек в виде одиночных, реже довольно крупных скоплений аномальных глобулярных образований, напоминающих по форме «цветок» диаметром 120-150 нм (рис. 4).

Полученные данные позволяют сделать следующее заключение.

Клиническая картина АЛ характеризуется постепенным развитием вялых парезов конечностей с неуклонным нарастанием их выраженности, которые сопровождаются распространенными фибрилляциями на протяжении всей болезни. Функции ЧН заметно не страдают, даже при нахождении пациентов на управляемом дыхании; все виды чувствительности сохранены. Выраженная прогредиентность всегда приводит к летальному исходу из-за расстройств дыхания исключительно спинального типа.

Основным и постоянным морфологическим признаком АЛ является поражение и гибель мотонейронов преимущественно в спинном мозге. Мотонейроны погибают по всему длиннику спинного мозга. Прежде всего поражаются крупные мотонейроны, а затем и мелкие, оставшиеся, как правило, без отростков, с измененной формой (округленные, вытянутые). Ядро нередко оттеснено к периферии клетки. Встречаются клетки как с просветленной цитоплазмой вследствие распада вещества Ниссля, иногда с мелкими вакуолями, так и гиперхромные, сморщенные. Число нейронов ядерных групп дна четвертого желудочка практически не снижается. Некоторые из них, а также нейроны олив, набухшие, иногда со скоплением липофусцина. Нервные клетки варолиева моста и ножек мозга без изменений.

При АЛ наблюдается характерное поражение аксонов, которое заключается в их вакуолизации с последующими сморщиванием и гибелью. Вследствие дегенеративных изменений аксонов, расширения периаксональных пространств на фоне неизменных миелиновых оболочек белое вещество спинного мозга приобретает спонгиозный вид. Морфологически спонгиозные изменения, обусловленные вакуолизацией аксонов, хорошо прослеживаются как на поперечных, так и продольных срезах спинного мозга.

В аутопсийных образцах головного мозга людей, погибших от АЛ, методом иммунного блоттинга всегда выявляется протеазоустойчивый прионный белок PrP27-30, агрегирующий в условиях детергентной экстракции и ферментативной обработки протеиназой К в характерные для патологических прионов полиморфные амилоидоподобные структуры, выявляемые при анализе электронограмм и АСМ-изображений. Более того, как показано ранее, и гомогенаты мозга, и полученные на их основе высокоочищенные фракции обладают инфекционностью и вызывают развитие патологического процесса in vivo [24].

Представленные результаты клинических, патогистологических и экспериментальных исследований в целом свидетельствуют о наличии у умерших от АЛ людей прионной инфекции ЦНС. Полученные новые факты дополняют ранее известные данные по этиопатогенезу АЛ и еще раз свидетельствуют о правомочности утверждения, что заболевание имеет прионную природу и входит в группу трансмиссивных губчатых энцефалопатий.