Врожденные мышечные дистрофии (ВМД) - гетерогенная группа наследственных болезней мышц. Врожденное или очень раннее (до 6 мес) начало отличает ВМД от других мышечных дистрофий и сближает с врожденными структурными миопатиями; отличием от последних является характер поражения мышц: если для врожденных миопатий типичны некротические или дегенеративные изменения мышечной ткани со специфичными патоморфологическими признаками отдельных нозологических форм, то при ВМД имеет место текущий миодистрофический процесс, не имеющий специфичных признаков при «обычном» исследовании мышечного биоптата. Все ВМД наследуются аутосомно-рецессивно и имеют тяжелое, глубоко инвалидизирующее течение, поэтому их клинико-молекулярно-генетическая диагностика чрезвычайно важна для медико-генетического консультирования. С развитием молекулярной генетики меняются представления о частоте и спектре ВМД: если прежде они считались крайне редкими, то, по современным данным, распространенность ВМД в европейских популяциях составляет около 0,8 больных на 100 000 населения [18, 20], выделено более 15 клинико-генетических форм, для большинства идентифицированы гены. Важную роль в исследованиях и практической диагностике ВМД играют также иммуногистохимические методы. Клинически ВМД подразделяют на «чистые» формы, при которых страдает исключительно мышечная система (вторично - костно-суставная), и формы со структурным поражением ЦНС (нередко и других органов), часть которых обозначают как синдромы. В 1960-70-х годах были описаны синдром Уокера-Варбург, исключительно «японская» ВМД Фукуямы, мышечно-глазо-мозговой синдром (МГМ) из числа «финских» болезней. По мере распространения методов нейровизуализации (КТ и МРТ) оказалось, что ВМД с вовлечением ЦНС не уникальны. В 1980-х годах в Европе и Америке появились описания ВМД с поражением белого вещества мозга, названной вначале «западным вариантом ВМД Фукуямы» и отличающийся от последней прежде всего отсутствием умственной отсталости; первые российские клинические наблюдения опубликованы в начале 1990-х годов [1-3]. В 1994 г. в мышцах таких больных выявили дефицит белка мерозина (α₂ цепь ламинина) [25], тогда же картировали ген мерозина, названный LAMA2 (Laminin α₂) [14], а в 1995 г. у больных ВМД обнаружили мутации LAMA2, ведущие к полному отсутствию или частичному дефициту мерозина [13]. ВМД, связанная с LAMA2, получила название мерозин-дефицитной или ВМД1A (MIM 607855). Большой размер гена LAMA2 (65 экзонов) и разнообразие мутаций, часть которых не выявляется рутинными методами, затрудняют и удорожают ДНК-диагностику ВМД1 А, однако в мире накоплены обширные клинико-молекулярно-генетические данные. В исследовательских целях широко используют также иммуногистохимическое определение мерозина в мышцах. Как показали многочисленные исследования, ВМД1А встречается повсеместно, а в Европе и Америке является самой частой, составляя 30-50% всех ВМД [4, 8, 12, 17, 18, 20, 29, 30].

В клинической практике мы диагностировали разные варианты ВМД, но возможность уточнения генетической формы болезни и пренатальной диагностики в отягощенных семьях появилась только в последние годы, когда стала проводиться ДНК-диагностика ряда ВМД, в частности, ВМД1А.

Цель настоящей работы - представить первые российские наблюдения ВМД1А, верифицированные анализом ДНК.

Поиск мутаций LAMA2 проведен в 5 неродственных семьях у 6 больных (включая 2 сибсов), у которых при обследовании была заподозрена ВМД1А.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполнено с помощью стандартного набора реактивов DIAtom^™ DNA Prer 100 (Isogene Lab.ltd, Россия) по протоколу производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на программируемом термоциклере МС2 («ДНК-технология», Россия) с использованием ДНК-полимеразы Biotaq («Биомастер») в объеме 25μ1 реакционной смеси. Поиск мутаций осуществляли методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру как с прямого, так и с обратного праймеров, на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) с использованием протокола производителя. В качестве матрицы для секвенирования использовали фрагменты ДНК, полученные после проведения ПЦР с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров (SYNTOL). Анализ результатов секвенирования проводили с помощью программ Chromas и BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Клиническое обследование включало генеалогический анализ, общий и неврологический осмотр, электронейромиографию (ЭНМГ), определение активности креатинфосфокиназы (КФК) в крови, МРТ головного мозга, у 2 больных - исследование мышечного биоптата (световая и электронная микроскопия). Иммуногистохимическое исследование мерозина в мышечной ткани не проводили.

Мутации LAMA2 обнаружены у 3 неродственных больных. Семьи П. и У. русские, родители не состоят в кровном родстве; семья С. этнически смешанная (русско-татарская); все пробанды - единственные дети в семьях. Представляем описания больных и результаты ДНК-диагностики.

Больной С. - ребенок от 1-й беременности, протекавшей с угрозой прерывания. Роды в 38 нед - экстренное кесарево сечение после длительного периода десинхронизации родовой деятельности (узкий таз у матери), в родах асфиксия плода. Масса тела при рождении - 3350 г, длина - 51 см, оценка по Апгар 7/8 баллов. С рождения отмечались выраженная мышечная гипотония и низкая двигательная активность, в связи с чем исключали спинальную амиотрофию Верднига-Гофмана. При ЭНМГ в 1,5 мес переднероговая активность и признаки первичного поражения мышц отсутствовали; выявленное снижение скоростей распространения возбуждения по периферическим нервам было расценено как физиологическая гипомиелинизация.

Впервые консультирован в Медико-генетическом научном центре (МГНЦ) в возрасте 2 мес. Отмечены выраженная диффузная мышечная гипотония, особенно в аксиальных мышцах и проксимальных мышцах конечностей, ограничение объема движений, арефлексия (синдром «вялого ребенка»), значительное переразгибание в коленных и голеностопных суставах с подвывихами, дисплазия тазобедренных суставов с подвывихом бедер. При МРТ были выявлены изменения перивентрикулярного белого вещества и гипоплазия мозолистого тела. Болезнь была расценена как последствия перинатального поражения ЦНС. В дальнейшем резко отставал в двигательном развитии: в 5 мес начал держать голову, но только при вертикальном положении тела; с 11 мес сидел, будучи посаженным, самостоятельно не садился; полностью не поворачивался, не ползал; движения в кистях были сохранны. В психоречевом развитии имелось небольшое отставание с положительной динамикой.

В возрасте 1 года 8 мес ребенок был направлен в МГНЦ вновь с подозрением на лейкодистрофию: так были расценены выраженные изменения плотности белого вещества теменно-затылочных и лобно-теменных долей при повторной МРТ. Клинически имел место выраженный проксимальный миопатический синдром без симптомов поражения ЦНС, психоэмоциональное развитие соответствовало возрасту. Было обращено внимание на повышенную активность КФК (500 Ед/л, возрастная норма до 200 Ед/л), оказавшуюся еще более высокой при повторном исследовании (850 Ед/л). Ранний тяжелый миопатический синдром с высокой КФК в сочетании с характерным поражением белого вещества мозга позволил нам диагностировать ВМД с поражением головного мозга и запланировать ДНК-диагностику (семья предполагала дальнейшее деторождение).

Первой была начата менее затратная ДНК-диагностика ВМД1С (ген FKRP), при которой тоже возможна гипомиелинизация мозга. При секвенировании фрагмента экзона 4, где концентрируются мутации FKRP, изменения нуклеотидной последовательности не были обнаружены. Продолжение ДНК-диагностики семья отложила.

Позже была проведена мышечная биопсия: патоморфологическая картина с множественными некрозами и атрофией мионов без признаков структурных миопатий соответствовала ВМД. Активность КФК колебалась в пределах 1300-600 Ед/л. При повторных ЭНМГ имелись признаки первичного поражения мышц и гипо/демиелинизации периферических нервов. К 4 годам у ребенка наросла мышечная атрофия, сформировались контрактуры коленных, голеностопных, плечевых и локтевых суставов; сила в проксимальных отделах рук и ног - 2 балла; интеллект сохранный, негрубые дислалия и дизартрия.

При ДНК-диагностике ВМД1А найдены две ранее не описанные мутации LAMA2 в компаунд-гетерозиготном состоянии: с.5422С>Т (Glnl808Stop) и c.7701delTinsGTGTCCCTAGGTGTCCCTA. Первая из них - нонсенс-мутация, ведущая к формированию преждевременного стоп-кодона в экзоне 37 и нарушению формирования I и II доменов мерозина. Вторая мутация со сдвигом рамки считывания изменяет аминокислотную последовательность экзона 55, в результате чего нарушается формирование С-терминального региона.

Больная П. родилась от 2-й беременности (1-я - мертворождение), протекавшей с угрозой прерывания в I и II триместрах, выраженным токсикозом, гестозом. Роды на 36-й нед путем кесарева сечения из-за угрозы гипоксии плода. Масса тела при рождении - 3050 г, длина - 50 см, закричала сразу, оценка по шкале Апгар 8/8 баллов. На 2-е сутки взяла грудь, выписана из родильного дома на 8-е сутки. В 1,5 мес заметили снижение двигательной активности и мышечную гипотонию.

На момент первого осмотра в МГНЦ в 5 мес не держала голову, не переворачивалась, при вертикализации не опиралась на ноги; отмечены сниженная двигательная активность, диффузная мышечная гипотония, арефлексия (синдром «вялого ребенка»), формирующиеся контрактуры локтевых, коленных, голеностопных суставов и межфаланговых суставов кистей. Клиническая картина указывала на ВМД или - с меньшей вероятностью - врожденную структурную миопатию. Для уточнения диагноза были рекомендованы мышечная биопсия и МРТ головного мозга.

При биопсии, проведенной только спустя 2 года, подтвержден диагноз ВМД: обнаружена выраженная атрофия мышечных волокон в сочетании с грубым разрастанием соединительной ткани, признаков структурных миопатий и феномена «рваных красных мышечных волокон» не найдено.

Девочка осмотрена повторно в 3,5 года. За период наблюдения не приобрела основных двигательных навыков: не переворачивается, самостоятельно не садится, не стоит. Наросли мышечные атрофии и контрактуры суставов, объем движений в конечностях минимальный, сила в мышцах рук - 3 балла, мышцах ног - 2 балла; отмечено вовлечение в процесс лицевой мускулатуры: гипотония мимических и жевательных мышц. Негрубо отстает в психоречевом развитии, речь дизартрична. Активность КФК 710 Ед/л. ЭНМГ: признаки первичного поражения мышц (значительное снижение амплитуды М-ответа с разрежением интерференционной кривой) в сочетании с признаками демиелинизирующей полинейропатии (скорость распространения возбуждения по срединному нерву снижена до 43 м/с, по большеберцовому - до 34 м/с). Эхокардиография: дилатация левого желудочка, пролапс митрального клапана, открытое овальное окно. МРТ (в 4,5 года) выявила характерную перивентрикулярную гипомиелинизацию.

При ДНК-диагностике найдены две ранее не описанные мутации LAMA2 в компаунд-гетерозиготном состоянии: С.38290Т (Argl277Stop) и c.7536delC. Первая мутация, точковая, изменяет аминокислотную последовательность экзона 26 и приводит к нарушению формирования IVa домена мерозина. Вторая мутация изменяет аминокислотную последовательность экзона 54, вследствие чего нарушается формирование С-терминального участка. Делеция одного нуклеотида в данном случае привела к образованию преждевременного стоп-кодона в положении 2546.

Больной У. обследован в МГНЦ в возрасте 6 лет. Беременность и роды протекали физиологично, оценка по Апгар 8/9 баллов, масса тела при рождении - 3600 г, длина - 50 см. В 1-е сутки жизни выявлены кривошея и подвывих левого бедра. В 3 мес начал держать голову, никогда самостоятельно не садился, не вставал, не ходил. Уже на 1-м году жизни была выявлена повышенная активность КФК (1100 Ед/л). Наблюдался с диагнозом: миопатия.

При осмотре отмечены диффузная мышечная слабость с вовлечением мимических и жевательных мышц, гипотрофия, гипотония, арефлексия, контрактуры коленных, голеностопных, локтевых, плечевых и межфаланговых суставов, «седловидная» деформация грудной клетки (рис. 1, а).

При ДНК-диагностике была обнаружена одна ранее не описанная мутация LAMA2 в гетерозиготном состоянии: замена С.6406ОТ в экзоне 45, приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона в положении 2136 (Gln2136Stop) (рис. 1, в).

Таким образом, 3 больных имеют сходную клиническую картину: врожденный/очень ранний тяжелый миопатический синдром с преимущественным поражением аксиальных мышц и проксимальных мышц конечностей, высокой активностью КФК (500-1300 Ед/л), рано формирующимися множественными контрактурами, вовлечением лицевых мышц (у всех больных), неспецифичными дистрофическими изменениями мышечного биоптата (у 2 обследованных) и сопутствующей демиелинизирующей полинейропатией (у 3 обследованных); другая общая составляющая клинической картины - выраженные стойкие изменения белого вещества головного мозга при сохранном (2 больных) или негрубо задержанном (1) умственном развитии, без симптомов очагового поражения ЦНС. Субклинические признаки поражения сердца у больной П., не носящие характера кардиомиопатии, расценены как независимые. Другой сопутствующей патологии и внешних признаков дисморфогенеза нет.

В семьях проведено медико-генетическое консультирование, разъяснен риск болезни у будущих детей (25%). Во всех 3-х семьях возможна дородовая ДНК-диагностика с комбинацией прямого и косвенного методов анализа ДНК. В семьях Д. и В. с клинической картиной ВМД1А у 3 больных мутаций LAMA2 не найдено.

Клиническая картина ВМД1А у наших больных достаточно типична. Действительно, в большинстве случаев болезнь проявляется до 6 мес чаще с рождения, ее основу составляет тяжелый прогрессирующий миопатический синдром с преимущественным поражением мышц туловища и проксимальных отделов рук и ног; больные самостоятельно не садятся (в лучшем случае сидят без опоры) и не ходят. В ряде случаев при вовлечении мышц, участвующих в дыхании и глотании, развиваются респираторный дистресс-синдром и дисфагия. В начале болезни мышцы лица не страдают, но позже у части больных возникает наружная офтальмоплегия. Кардиомиопатия нехарактерна. Активность КФК всегда повышена. Чаще она не превышает 1500 Ед/л (как у наших больных), но может быть гораздо более высокой: так, у 26 больных 9 мес - 24 лет, наблюдавшихся J. Oliviera и соавт. [19], наибольшие зарегистрированные показатели КФК варьировали в интервале 600-7000 Ед/л. С возрастом активность КФК снижается (как у больного У.), что отражает далеко зашедший процесс и значительную утрату мышечной массы. Типичны ранние контрактуры крупных суставов и межфаланговых суставов кисти. Характерна демиелинизирующая полинейропатия, которая может не проявляться клинически и не всегда регистрируется при ЭНМГ. Отличительный и диагностически очень важный признак - поражение белого вещества головного мозга, выявляемое при КТ и особенно при МРТ (гипо- и гиперинтенсивный сигналы от белого вещества в режимах Т1 и Т2 соответственно); наиболее типично двустороннее поражение перивентрикулярного белого вещества теменных, лобных и височных отделов [15]. Эти выраженные и стойкие изменения, как правило, не вызывают очаговой неврологической симптоматики, не сопровождаются снижением интеллекта и расстройствами психики, т.е. бессимптомны (как у больных С. и У). Поэтому подозрение на ВМД даже без симптомов поражения ЦНС является показанием для проведения МРТ мозга. При этом надо учитывать, что в периоде новорожденности и первые месяцы жизни МРТ малоинформативна для характеристики белого вещества из-за физиологической демиелинизации (как у больного С). Ранней диагностике может препятствовать отягощенный перинатальный анамнез, поначалу «маскирующий» генетическую природу болезни (как у больных С. и П). Вместе с тем у этих больных, наблюдавшихся нами длительно, клинический диагноз ВМД был установлен достаточно рано, на 1-2-м годах жизни, но уточнение ее формы было отсрочено, так как семья откладывала обследование. В дифференциальной диагностике с перинатальной патологией и лейкодистрофиями помогает широко доступное определение активности КФК.

Наряду с типичными случаями накапливаются наблюдения редких и атипичных проявлений. Во-первых, часть больных имеет клинические проявления поражения ЦНС. По данным ряда авторов, снижение интеллекта (негрубое) и/или эпилепсия наблюдаются лишь у 5-10% больных). Из 26 больных, наблюдавшихся J. Oliviera и соавт. [19], 1 страдал эпилепсией и у 1 наблюдался легкий интеллектуальный дефект (у последнего имелись другие атипичные симптомы, указывающие на сочетание с негенетической патологией). Однако К. Jones и соавт. [16], обобщившие все наблюдения ВМД1А, опубликованные к 2004 г., приводят гораздо более высокую частоту снижения интеллекта - 30%. Отчасти различия цифр могут быть связаны с возрастом и сроком наблюдения больных. Негрубая задержка психоречевого развития у нашей больной П. может быть связана как с основным заболеванием, так и перинатальным поражением ЦНС, состояние ее интеллекта требует наблюдения. Другая группа атипичных случаев отличается менее тяжелым течением миодистрофии: более поздним началом (вплоть до 12 лет!), возможностью ходьбы; при поздних формах встречается псевдогипертрофия мышц, нехарактерная для «классического» варианта. По обобщенным данным, относительно «мягкие» формы, более сходные с конечностнопоясной миодистрофией, составляют около 12% [16]. Такие случаи чаще встречаются при частичном дефиците мерозина [9, 10, 16, 19, 23, 24]. В выборке J. Oliviera и соавт. [19] самостоятельно ходили 3 больных 18, 20 и 24 лет; 2 из них имели частичную недостаточность мерозина, а генотипически - компаунд-гетерозиготность по мутации, ведущей к обрыву белка с полной инактивацией, и миссенс-мутации, обеспечивающей его остаточную активность (у 3-го больного иммуногистохимическое исследование не проводилось). С. Di Blasi и соавт. [10, 11] описали 29-летнего больного с поздним началом болезни, частичным дефицитом мерозина и атипичной картиной мышечного биоптата, напоминавшей миозит с включениями (редкая форма полимиозита с дистальной слабостью). Больная с гомозиготностью по делеции со сдвигом рамки считывания в экзоне 56 и следовым количеством мерозина при гистохимическом исследовании ходила в 13 лет [22]. Возможность ходьбы описана и у больных с полным отсутствием мерозина. Необычное течение ВМД1А наблюдали P. Vigliano с соавт. [27]: больная с полным отсутствием мерозина и гомозиготностью по нонсенс-мутации LAMA2 ходила самостоятельно до 7 лет, когда начались эпилепсия и деменция, после чего утратила способность ходьбы; при МРТ, кроме поражения белого вещества, выявлялась распространенная двусторонняя затылочная микрополигирия. Этот случай иллюстрирует также достаточное разнообразие МРТ-картины при ВМД1 А. Действительно, помимо изменений белого вещества (степень и локализация которых варьируют), описаны локальная дисплазия коры (пахигирия, микрополигирия), гипоплазия червя мозжечка, мозолистого тела, гипофиза [5, 7, 17, 19, 21]; как и поражение белого вещества, эти дополнительные МРТ-признаки чаще не проявляются клинически. Наконец, известны случаи ВМД1А без изменений МРТ [16, 23]. Таким образом, клинический спектр ВМД1А значительно шире, чем предполагалось. Это надо учитывать при отборе больных для молекулярно-генетической и иммуногистохимической диагностики, не ограничиваясь «классическим» фенотипом.

Продолжительность жизни при ВМД1А варьирует от нескольких лет при очень тяжелых формах до 30 лет и более. Специфичного лечения нет.

Таблица позволяет сравнить ВМД1А и другие ВМД с поражением головного мозга (в таблицу не включены их общие признаки: тяжелый миопатический синдром и ранние контрактуры).

Клинические признаки ВМД1А находят объяснение в характеристиках гена и белка: очень раннее начало большинства случаев объясняется участием мерозина в формировании мышечных волокон в эмбриогенезе; полинейропатия и демиелинизация головного мозга при ВМД1А отражают экспрессию LAMA2 не только в поперечнополосатых мышцах (базальной мембране), но также в периферических нервах и ЦНС (главным образом в шванновских клетках и синаптических структурах).

Полипептидная цепь мерозина включает 3088 аминокислот и 22 сигнальные последовательности и имеет доменную структуру. 6 белковых доменов выполняют специфические функции в белковой молекуле. В мышечном волокне мерозин локализован в экстрацеллюлярном матриксе и обеспечивает сцепление белков сарколеммы и коллагеновых волокон. Он представляет собой гетеротример, состоящий из трех полипептидных цепей - тяжелой цепи α₂ и двух легких цепей β₁ и γ₁. Выделяют длинное плечо и 3 коротких плеча мерозина. Длинное плечо сформировано 3 закрученными вдоль оси полипептидными цепями и стабилизируется дисульфидными связями и взаимодействует с белками дистрогликанового комплекса саркомеры мышечных волокон. Короткие плечи формируют крестообразную структуру и обеспечивают связь мерозина с коллагеном 6-го типа межклеточных пространств (рис. 3).

Взаимодействие мерозина с белками сарколеммы осуществляется с помощью 2 механизмов. С одной стороны, он является лигандом α-дистрогликанов, входящих в дистрофин-гликопротеиновый комплекс, с другой - он взаимодействует с мембранным рецептором миофибрилл - интегрином (см. рис. 3).

В настоящее время зарегистрировано более 200 мутаций LAMA2 у почти 600 больных [15, 28]. Наиболее типичны делеции и мутации, приводящие к образованию стоп-кодона (как и в наших наблюдениях), тогда как миссенс-мутации редки. Имеются гено-фенотипические корреляции: при легком течении болезни чаще обнаруживают мутации без сдвига рамки считывания [15, 28]. Доля молекулярно-генетически подтвержденных случаев у больных с предварительным клиническим диагнозом ВМД1А в разных исследованиях варьирует. В выборке J. Oliviera и соавт. [19] она очень высока: 96% (25 из 26 больных). Это обеспечивается не только строгим отбором больных (у большинства предварительно проведено иммуногистохимическое исследование), но и применением широкого спектра методов ДНК-анализа, что позволило наряду с точковыми мутациями и малыми делециями и инсерциями обнаружить крупную делецию гена у 8 больных. Рутинные же методы анализа ДНК не выявляют атипичные мутации LAMA2 (в частности, крупные делеции), доля которых достигает 30-40%. Этим объясняется «отсутствие» второй мутации у больного У. В семьях Д. и В., где мутации не были обнаружены, также возможна ВМД1А с атипичными мутациями LAMA2. В подобных случаях для подтверждения диагноза проводят иммуногистохимическое исследование мерозина в мышечной ткани. При верифицированном диагнозе возможна дородовая ДНК-диагностика с использованием косвенных методов. Отметим, что дефицит мерозина в мышцах сам по себе не патогномоничен для ВМД1 А. В частности, он выявлен при ВМД1В [6]. Эта «чистая» ВМД описана всего в 2 семьях разной этнической принадлежности, ген картирован в локусе lq42. Авторы считают, что дефицит мерозина в обеих семьях носит вторичный характер и косвенно указывает на связь ВМД 1В с одним из белков, взаимодействующих с мерозином. Возможность неспецифичного дефицита мерозина надо учитывать при иммуногистохимических исследованиях.

Таким образом, в диагностике и дородовой диагностике ВМД1А наиболее надежен комплексный подход, сочетающий иммуногистохимические методы, прямые и косвенные методы ДНК-анализа. В мире накоплен значительный опыт пренатальной диагностики ВМД1А.

M. Vainzhof и соавт. [26] обобщили материал 5 центров, где за 1995-2004 гг. было проведено 114 пренатальных исследований: комплексный подход обеспечил высокую надежность диагностики без ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Основой генетической профилактики ВМД1А в отягощенных семьях является ее своевременная диагностика у больных.