Несмотря на повышенный интерес исследователей к нитроксидергическому пути передачи нервного импульса, этот процесс до настоящего времени вызывает противоречивые оценки. Это касается как наличия и количественного распределения фермента синтеза оксида азота (NO) в нервных центрах, его активности в отдельных нейронах, так и неоднозначной физиологической роли этой газообразной молекулы в обеспечении работы ЦНС, в том числе в регуляции артериального давления (АД) [3, 16, 21, 24]. Хотя участие NO в реализации функций вазомоторного центра признается многими исследователями [10, 21], данные о локализации и количественном распределении нитроксидергических нейронов (NO-нейронов) в ядрах продолговатого мозга у здоровых людей и их изменениях в зависимости от степени артериальной гипертензии (АГ) ограничиваются несколькими противоречивыми сообщениями [10, 20].
Целью данной работы явилось изучение распределения NO-нейронов и активности в них нейрональной NO-синтазы (nNOS) в некоторых ядрах продолговатого мозга людей, страдавших при жизни АГ I-III степени (АГ I-III).
Материал и методы
Для исследования использован материал судебно-медицинских вскрытий мужчин в возрасте 18-44 лет, погибших в результате дорожно-транспортных происшествий. Артерии мягкой мозговой оболочки взяты у 8 практически здоровых мужчин (контрольная группа) и 19 мужчин с диагностированной при жизни АГ I-III, погибших от травм, не связанных с повреждением головного мозга.
Из продолговатого мозга делали срезы с двух уровней, позволяющих наиболее полно изучать ядра. Препараты исследовали раздельно в двух микроскопах, в окуляры которых помещали одинаковые сетки с равновеликими квадратами. Изучаемое ядро в обоих микроскопах ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях и переносили на миллиметровую бумагу в соответствии с их положением относительно координат сетки. Исследовали дорсомедиальную часть ядра солитарного тракта (ЯСТ), вентральное ретикулярное гигантоклеточное ядро (РГЯ), ретикулярное центральное ядро (РЦЯ), ретикулярное мелкоклеточное ядро (РМЯ), ретикулярное латеральное ядро (ЛРЯ) и дорсальное ядро блуждающего нерва (ДЯБ). NO-нейроны маркировали методом В. Hope и S. Vinsent [17] для выявления NADPH-диафоразы (NADPH-d). Специфичность гистохимической реакции проверяли инкубацией нескольких срезов в растворах, не содержащих нитросиний тетразолий или NADPH, а также в растворе, содержащем NADP вместо NADPH. Поскольку химическая основа реакции заключается в образовании преципитата формазана при восстановлении солей тетразолия в присутствии NADPH-d, то гистохимическая реакция не должна наблюдаться в случае отсутствия в инкубационной среде любого из основных ее компонентов. В проекции среза каждого ядра при помощи автоматизированной системы анализа изображений Allegro MC определяли абсолютное число нейронов, маркированных окраской по Нисслю, и долю среди них, приходящуюся на NO-нейроны. Кроме того, вычисляли средний показатель активности (СПА) фермента (в ед. опт. пл.) в нейронах каждого ядра в отдельности, в соответствии с приведенной ранее методикой [4]. Поскольку количество осадка диформазана, образующегося при реакции на NADPH-d, пропорционально молекулярному содержанию nNOS, то на основании плотности преципитата можно судить об активности последней в нервных клетках [26].
Реакция на NADPH-d позволяет не только идентифицировать nNOS в клетках, но и определить количественное соотношение NO-позитивных нейронов, отличающихся активностью фермента [5, 8, 17]. Среди этих клеток вычисляли долю нейронов с низкой (тип I), средней (тип II), высокой (тип III) и очень высокой (тип IV) активностью фермента.
При статистической обработке результатов для оценки значимости цифровых данных использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты
Во всех ядрах у обследованных контрольной группы выявлялись NO-позитивные нейроны, отличающиеся структурой и плотностью выпавшего осадка, в результате чего их цитоплазма окрашивалась в различные оттенки синего цвета - от голубого до фиолетового (рис. 1, а, б). Доля NO-нейронов в исследованных ядрах колебалась от 17,4% (ДЯБ) до 44,9% (РЛЯ) (см. таблицу). Там, где таких нейронов было много, они располагались недалеко друг от друга. Независимо от плотности расположения NO-позитивных клеток маркировались также отростки нейронов, капилляры, иногда глиальные клетки. В исследованных ядрах определялись и различия количественного соотношения NO-позитивных нейронов, отличающихся активностью nNOS (см. таблицу). Как видно, в ЯСТ и ДЯБ определялась наибольшая доля клеток типа I, и отсутствовали или встречались в ограниченном количестве клетки типов III и IV. В ретикулярных ядрах, напротив, преобладали нейроны с высокой активностью фермента.
При АГ I в большинстве ядер наблюдалось значительное снижение активности nNOS, хотя доля NO-нейронов существенно не менялась (см. таблицу). Лишь в ЯСТ относительное содержание нейронов, экспрессирующих nNOS, достоверно сокращалось (р<0,05). В этом ядре большинство нейронов было представлено клетками с низкой активностью фермента (рис. 2, а). Доля клеток типа II была снижена, а нейроны с высокой активностью nNOS практически исчезли из поля зрения: на редких срезах можно было встретить 1-2 такие клетки. Перераспределение клеток в ядре в сторону нейронов I типа приводит к тому, что СПА фермента у больных ранней формой АГ сокращается по сравнению с группой практически здоровых людей более чем в 2 раза.
В ретикулярных ядрах последовательность преобразований исследованных показателей во многом повторяла отмеченную в ЯСТ, однако изменения были выражены в меньшей степени. Так, численная плотность NO-позитивных нейронов в этих ядрах или незначительно (на 5-8%) снижалась (РЛЯ и РГЯ), или оставалась на уровне контрольных значений, как в РМЯ, РЦЯ (см. таблицу). Среди ретикулярных ядер наибольшие изменения величины показателей были выявлены в РЛЯ. В этом ядре различия СПА фермента и доли клеток типов I-IV между практически здоровыми людьми и при АГ I достигали 25-30%. В РЛЯ постоянно встречались NO-нейроны III и IV типов, хотя самую многочисленную группу составляли клетки со средней активностью фермента (рис. 2, б). В РМЯ и РГЯ также были выявлены достоверные отличия исследованных параметров по сравнению с контрольными цифрами, однако они не столь значительны как в РЛЯ (см. таблицу). В РЦЯ изменения исследуемых параметров являлись минимальными и достоверны лишь в отношении СПА фермента.
При АГ II во всех ядрах наблюдалось выраженное сокращение доли NO-нейронов, однако дальнейшего снижения активности nNOS в большинстве ядер не происходило (см. таблицу). Исключение составляло ДЯБ, в котором величина большинства показателей имела тенденцию к повышению. В ЯСТ относительное содержание NO-нейронов сокращалось почти в 2,5 раза по сравнению с контрольными значениями, и более чем на ⅓ - с цифрами, установленными при АГ I (р<0,05). Поскольку в этом ядре нейроны I-II типа и при АГ II остаются преобладающей группой клеток, то значение СПА остается достоверно ниже контрольных цифр, но существенно не отличаются от величины показателя, установленного при АГ I (р>0,05). Кроме того, в составе ядра появляется небольшая группа клеток с высокой активностью фермента. В ретикулярных ядрах доля NO-нейронов также снижается, хотя и не так существенно, как в ЯСТ. При этом особенно значительное сокращение энзимпозитивных клеток наблюдалось в РЛЯ. По сравнению с контролем их доля снизилась до 40%, а с АГ I - до 62% (р<0,05). Величина СПА фермента оставалась существенно меньше контрольных значений и лишь на 3-4% ниже, чем при АГ I (р>0,05). По-прежнему большинство клеток отличались невысокой активностью nNOS. Меньше других изменения затрагивали РЦЯ, хотя и здесь доля NO-нейронов достоверно снижалась как по сравнению с величиной показателя, установленной у практически здоровых людей, так и при АГ I (см. таблицу).
При АГ III наблюдалось некоторое повышение активности nNOS и незначительное по сравнению с АГ II сокращение доли NO-нейронов (р>0,05). В ДЯБ величина исследованных показателей повышалась в среднем на 14-18%. Увеличение СПА фермента в ядре происходило в основном за счет увеличения доли нейронов III и IV типов. В ЯСТ относительное содержание NO-нейронов оставалось значительно ниже контрольных значений, но практически не менялось по сравнению с цифрами, установленными при АГ II (р>0,05). Наблюдалось некоторое повышение значений СПА за счет увеличения доли нейронов II-III типов. В РЛЯ изменения были наибольшими, хотя по сравнению с АГ II разница значений для большинства показателей не превышала 10-14%. В то же время в РЦЯ эти различия составляли не более 2-3% и достоверны лишь в отношении значений доли NO-нейронов по сравнению с контролем (см. таблицу).
Обсуждение
Экспериментальные работы последних лет свидетельствуют, что молекулярные регуляторы, синтезируемые в нервной ткани, в том числе NO, принимают активное участие в нейрогенных механизмах формирования АГ [1, 3, 19]. NO на центральном уровне оказывает ингибирующее влияние на симпатическую активность и способствует снижению АД [3, 23, 24]. При сокращении синтеза NO наблюдается противоположный эффект - повышение сосудистого тонуса [8, 11]. Реализация симпатоингибиторных влияний происходит в ядрах так называемого бульбарного вазомоторного центра. Участие NO в этом процессе признается многими исследователями [18, 19, 21], но морфологических подтверждений явно недостаточно.
Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют об особенностях количественного распределения NO-нейронов и активности в них nNOS в некоторых ядрах бульбарного вазомоторного центра у здорового человека и их изменениях при АГ. Как показали наши наблюдения, NO-позитивные нейроны постоянно находятся в исследованных ядрах продолговатого мозга, где их количество в норме колеблется от 17,4 до 44,9%. В некоторых работах [2] приводятся более высокие цифры относительного содержания NO-нейронов в ЯСТ и ДЯБ (68-72%). По-видимому, это связано с тем, что авторами подсчитывались нейроны, в том числе и с неспецифическим окрашиванием клеток. Иммуноцитохимические методы обычно демонстрируют более низкое содержание таких нейронов в структурах мозга [9]. В физиологических условиях NO, облегчая процессы передачи сенсорной информации внутри ядра солитарного тракта, усиливает барорецепторное торможение симпатической вазомоторной активности, способствуя тем самым снижению АД [14, 24, 27].
При АГ I наблюдается значительное уменьшение активности nNOS в клетках, тогда как относительное содержание NO-нейронов в большинстве ядер существенно не меняется. В отличие от начальной формы заболевания, при АГ II отмечается выраженное сокращение доли NO-нейронов, но дальнейшего снижения активности nNOS не наблюдается. При АГ III активность nNOS возрастает при незначительном по сравнению с АГ II сокращении доли NO-нейронов. Однако и у этих больных относительное содержание энзимпозитивных нейронов остается существенно ниже контрольных значений. Исключение составляет ДЯБ, в котором величина большинства показателей повышается.
Таким образом при АГ, во-первых, наблюдается снижение количественных показателей, характеризующих состояние нитроксидергической системы, что является одной из причин гиперактивации симпатической нервной системы и повышения АД [8, 11]. Снижение синтеза NO и сопутствующая гиперактивация симпатической нервной системы провоцируют ремоделирование сосудистой стенки и способствуют закреплению АГ [12]. Во-вторых, в ЯСТ, являющемся областью вторичных афферентных нейронов барорецепторной дуги [2, 13], отмечаются более ранние и выраженные изменения величины показателей по сравнению с другими ядрами, что может быть связано с более серьезными нарушениями нитроксидергических механизмов (прежде всего, синтез NO) при АГ в афферентном звене рефлекторной дуги. Ранее было показано, что разрушение ЯСТ, где происходит переключение барорецепторного рефлекса с афферентных нервов, идущих от дуги аорты, на эфферентные нейроны ретикулярных ядер, вызывает тяжелую гипертензию [8, 11, 25]. Аналогичный эффект оказывает введение ингибиторов синтеза NO в область ядра [20]. В-третьих, величина этих отклонений существенно отличается в ретикулярных ядрах при различной степени АГ, что предполагает неодинаковое участие каждого из них в активации преганглионарных симпатических нейронов промежуточно-латерального ядра спинного мозга, о чем свидетельствуют и проведенные ранее экспериментальные исследования [11]. В-четвертых, существенное снижение доли NO-нейронов наблюдается только при АГ II-III, т.е. при АГ I имеется субстрат для восстановления исходного тонуса сосудов в случае своевременной коррекции функций симпатической нервной системы. В-пятых, при АГ изменения активности nNOS и относительного содержания NO-нейронов в ДЯБ, по сравнению с другими исследованными ядрами, носит во многом противонаправленный характер. Это может быть связано с тем, что ДЯБ, в отличие от остальных исследованных нами ядер, является холинергическим, а ацетилхолин - медиатор его аксонов - агонист nNOS, экспрессия которой осуществляется через никотиновые рецепторы путем стимуляции Са2+-зависимой протеинкиназы С [6, 8]. При холинергическом механизме активации nNOS включается депрессорный контур регуляции сосудистого тонуса, основным элементом которого, безусловно, является NO, провоцирующий снижение АД. При АГ, по-видимому, происходит компенсаторная активация нитроксидергической системы, приводящая в итоге к дисбалансу внутри самой регуляторной системы, способствуя закреплению стабильной АГ. Косвенным подтверждением этому могут служить полученные нами данные о том, что выраженность изменений в ДЯБ нарастает от АГ I к АГ III. Соответствующие сигналы к его нейронам могут поступать из ЯСТ, в котором большинство NO-позитивных афферентов вагусного происхождения [2].
Нарушение синтеза NO, а также сокращение числа клеток, экспрессирующих nNOS, наблюдающееся при АГ II-III, приводит к стойкой гипертензии. В настоящее время известно несколько потенциальных механизмов нарушения синтеза NO и его действия как естественного регулятора сосудистого тонуса [22]: нарушение экспрессии и образование аномальной NOS; нарушение функции NOS; нарушение процесса деградации NO. В последние годы активно изучаются генетически детерминированные нарушения синтеза NO [7]. Одной из возможных причин снижения синтеза NO является повышенное образование эндогенных ингибиторов NOS, в частности N-монометиларгинина и ассиметричного диметиларгинина. Известно, что применение этих условиях экзогенного L-аргинина нормализует синтез NO и величину АД [15].