Ультраструктура клеток Сертоли и сперматогониев при лечебно-профилактическом применении низкоинтенсивных электромагнитных излучений в условиях радиационного облучения крыс

Читать метаданные

В различных экспериментальных исследованиях было установлено, что радиационное облучение оказывает негативное воздействие на процессы сперматогенеза. При этом в семенниках выявлялись нарушения микроциркуляции, клеточная и внутриклеточная дезинтеграции, выраженные деструктивные изменения клеток, вплоть до их гибели. Цель — выявить ультраструктурные нарушения в клетках Сертоли и сперматогониях в условиях радиации и изучить особенности их регенерации при лечебно-профилактическом применении низкоинтенсивного электромагнитного излучения (ЭМИ) сверхвысокой частоты (СВЧ) и низкоинтенсивного магнитного поля (МП) низкой частоты (НЧ). Материал и методы. Эксперименты были проведены на 28 половозрелых нелинейных крысах-самцах массой 180—220 г. Все крысы были разделены на четыре группы: 2 опытные, 1 контрольную и группу интактых животных. В 1-й опытной группе животных подвергали радиационному облучению с последующим воздействием низкоинтенсивным ЭМИ СВЧ; во 2-й опытной группе — радиационному облучению с последующим воздействием низкоинтенсивным МП НЧ; в 3-й группе (контроль) — только радиационному облучению; 4-ю группу составляли интактные крысы, которые никаким воздействиям не подвергались. Результаты. С помощью метода электронной микроскопии установлено, что лечебно-профилактическое применение ЭМИ СВЧ и МП НЧ вызывало снижение уровня пострадиационных нарушений в исследованных клетках и усиливало развитие их клеточной и внутриклеточной регенерации. ЭМИ СВЧ оказывало более выраженное стимулирующее влияние на процессы регенерации, чем МП НЧ. Особенно активно процессы внутриклеточной регенерации развивались в клетках Сертоли, что проявлялось в увеличении числа и размеров митохондрий, усилении гиперплазии рибосом и полисом, образовании новых мембран гранулярной эндоплазматической сети. В сперматогониях внутриклеточная регенерация проявлялась слабее, но при этом она сочеталась с усилением клеточной регенерации и повышением численности резерва стволовых/прогениторных клеток. Заключение. Результаты проведенного исследования обосновывают возможность использования МП НЧ и особенно ЭМИ СВЧ для разработки перспективных лечебно-профилактических технологий в целях их использования в клинической практике при радиационной патологии.

Ключевые слова:

низкоинтенсивные электромагнитные излучения

радиационное облучение

клетки Сертоли

сперматогонии

ультраструктурные изменения

клеточная регенерация

внутриклеточная регенерация

Авторы:

Королев Ю.Н.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздравсоцразвития России, Москва

Бобровницкий И.П.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздрава РФ, Москва

Гениатулина М.С.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздравсоцразвития России, Москва

Никулина Л.А.

НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко РАМН, Москва

Михайлик Л.В.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздравсоцразвития России, Москва

Закрыть метаданные

В различных экспериментальных исследованиях было установлено, что радиационное облучение оказывает негативное воздействие на процесс сперматогенеза. При этом в семенниках выявлялись нарушения микроциркуляции, клеточная и внутриклеточная дезинтеграции, выраженные деструктивные изменения клеток, вплоть до их гибели [1—3]. Предупредить или ослабить эти нарушения можно с помощью низкоинтенсивных электромагнитных излучений (ЭМИ), которые оказывают стимулирующее влияние на регенеративные и компенсаторно-приспособительные процессы в разных органах и функциональных системах. К ним относятся, в частности, низкоинтенсивное ЭМИ сверхвысокой частоты (СВЧ) и низкоинтенсивное магнитное поле (МП) низкой частоты (НЧ) [4]. Особый интерес представляет изучение ультраструктурных проявлений регенеративных процессов в таких различных по структуре и функции клетках, как сперматогонии, размножение которых составляет начальную фазу сперматогенеза, и клетки Сертоли, выполняющие важные функции по обеспечению различных этапов сперматогенеза. Следует отметить, что клетки Сертоли, являясь соматическими, имеют тесный контакт со сперматогониями, входят в состав их микроокружения и продуцируют факторы, необходимые для развития как сперматогониев, так и других половых клеток. При действии радиации эти клетки подвергаются деструктивным изменениям, особенно сперматогонии, которые подразделяются на типы, А (менее зрелые стволовые/прогениторные клетки) и В (более зрелые популяции клеток). Последние особенно чувствительны к воздействию радиации [5], что связано с их высокой митотической активностью. Можно предположить, что применение ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиации позволит активизировать развитие процессов регенерации и ослабить уровень деструктивных процессов в исследуемых клетках.

Цель исследования — выявить ультраструктурные нарушения в клетках Сертоли и сперматогониях в условиях радиации и изучить особенности их регенерации при лечебно-профилактическом применении низкоинтенсивных ЭМИ СВЧ и МП НЧ.

Материал и методы

Эксперименты были проведены на 28 полово-зрелых нелинейных крысах-самцах массой 180—220 г. Все крысы были разделены на четыре группы: 2 опытные, 1 контрольную и группу интактных животных. В 1-й опытной группе животных подвергали радиационному облучению с последующим воздействием низкоинтенсивным ЭМИ СВЧ; во 2-й опытной группе — радиационному облучению с последующим воздействием низкоинтенсивным МП НЧ; в 3-й группе (контроль) — только радиационному облучению; 4-ю группу составляли интактные крысы, которые никаким воздействиям не подвергались. Животных опытных и контрольной групп облучали с помощью аппарата «Агат-Р» гамма-лучами ⁶⁰Со в дозе 2 Гр. Для электронно-микроскопических исследований семенники фиксировали в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,4), постфиксировали в 1% растворе OsO₄. После обезвоживания образцы заключали в смесь эпон—аралдит. Исследование образцов производили с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Германия) с программой Carl Zeiss STM Nano Technology system Division, которая включает в себя математическую обработку внутриклеточных структур.

Работу проводили в лаборатории экспериментальных исследований отдела диагностических технологий ФГБУ НМИЦ Р.К. Минздрава России. Радиационное облучение животных осуществляли с помощью аппарата Агат-Р в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Лечебно-профилактические мероприятия начинали проводить через 3 нед (21 день) после радиационного облучения. Воздействие низкоинтенсивным ЭМИ СВЧ (на курс 10 процедур) проводили на поясничную область животных с помощью аппарата Акватон-02 (плотность потока мощности менее 1 мкВт/см², частота около 1000 МГц, время воздействия 2 мин). Воздействие низкоинтенсивным МП НЧ также проводили на поясничную область с помощью аппарата МУМ-50 ЭДМА (постоянное и переменное МП 50 Гц с магнитной индукцией 35 мТл, время воздействия 2 мин). Забой животных осуществляли на следующий день после окончания процедур (через 1 мес после радиационного облучения).

Проводили морфометрический анализ митохондрий в клетках Сертоли и сперматогониях — оценивали количество, среднюю и суммарную площадь. Осуществляли подсчет клеток Сертоли, сперматогониев типов, А и В, а также числа этих клеток с различным содержанием рибосом и гранулярного эндоплазматического ретикулума.

Животные содержались в обычных условиях вивария и свободного доступа к воде и пище. Исследование осуществляли в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977) и требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986 г.).

Количественную оценку полученных данных проводили с помощью методов вариационной статистики. Для оценки достоверности различий сравниваемых средних величин использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты

Исследования показали, что через 1 мес после действия радиации у животных контрольной группы были выявлены отечность собственной оболочки семенных канальцев и очаги локального отека между клетками и базальной мембраной. В клетках Сертоли и сперматогониях были обнаружены нарушения со стороны различных субклеточных структур. Для клеток Сертоли характерными являлись дегрануляция и фрагментация гранулярной эндоплазматической сети, расширение просветов их цистерн, при слиянии которых образовывались крупные вакуоли; митохондрии уменьшались в размерах, отдельные из них подвергались деструкции, развивались псевдомиелиновые структуры из митохондрий, нарушались внутриклеточные контакты между различными органеллами. Общее число сперматогониев и сперматогониев типа, А было резко сниженным, что свидетельствовало о выраженном ослаблении их резерва, а число сперматогониев типа В, наоборот, становилось увеличенным, что приводило к выраженному дисбалансу в содержании этих клеток. Снижение числа сперматогониев типа А, по-видимому, было связано с их делением и переходом в более зрелый тип В. Эта реакция клеток по своей сущности являлась компенсаторно-приспособительной на деструктивные процессы в сперматогенном эпителии, особенно в сперматогониях типа В, которые, по данным литературы [6], практически полностью подвергались гибели при радиационном облучении в дозе 1 Гр. Поэтому можно полагать, что увеличенное число сперматогониев типа В являлось новой генерацией клеток, в которой замедлены (нарушены) процессы созревания и дифференцировки в гаплоидные клетки. При ультраструктурном анализе в сперматогониях разных типов были выявлены уменьшение содержания рибосом и полисом, расширение перинуклеарного пространства и просветов гранулярной эндоплазматической сети, дистрофические изменения отдельных митохондрий с локальными просветлениями матрикса. Таким образом, действие радиации приводило к ослаблению биосинтетических процессов в исследованных клетках, нарушению регенерации и снижению уровня компенсаторно-приспособительных реакций.

При применении низкоинтенсивных ЭМИ СВЧ и МП НЧ (1-я и 2-я опытные группы животных соответственно) явления деструкции и отека значительно ослаблялись, а процессы клеточной и внутриклеточной регенерации отчетливо усиливались. При этом обнаруживались характерные особенности в их развитии в зависимости от типа клеток и действующего фактора. Под влиянием МП НЧ в клетках Сертоли развивались процессы гиперплазии митохондрий, число которых увеличивалось на 57,7% (р<0,01) по сравнению с группой контроля (табл. 1, рис.

Таблица 1. Морфометрическая характеристика митохондрий клеток Сертоли при воздействии ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиационного облучения Примечание. ⁺ — р<0,01 — по сравнению с 4-й группой; * — р<0,01 — по сравнению с 3-й группой; ^o — р<0,01 — сравнение между 1-й и 2-й опытными группами.

1, 2,

Рис. 1. Морфометрическая характеристика митохондрий клеток Сертоли при радиационном облучении (контроль), воздействии МП НЧ и ЭМИ СВЧ. ⁺ — р<0,01 — по сравнению с интактной группой; * — р<0,01— по сравнению с контрольной группой; ^o — р<0,01 — сравнение между 1-й и 2-й опытными группами.

Рис. 2. Ультраструктура клеток Сертоли при радиационном облучении (контроль), воздействии ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиации. Ув. 20 000. а — радиационное облучение (контроль) — зона контакта клетки Сертоли и сперматогония (сп), явления отека неклеточного слоя (обозначено стрелкой) собственной оболочки семенного канальца, скопление жидкости между клетками и базальной мембраной (бм), формирование псевдомиелиновой структуры из митохондрий; б — восстановление структуры собственной оболочки семенного канальца, увеличение числа мелких митохондрий при воздействии МП НЧ; в — увеличение размеров митохондрий и числа крист при воздействии ЭМИ СВЧ.

а, б). Митохондрии становились более мелкими со сниженным числом крист. Средняя их площадь уменьшалась на 20% (р<0,01), однако суммарная площадь, наоборот, возрастала до уровня интактных животных за счет резкого увеличения численности митохондрий. При воздействии ЭМИ СВЧ в клетках Сертоли происходило статистически значимое увеличение как количества (на 34,3%; р<0,01), так и средней площади (на 20%; р<0,01) митохондрий, что отчетливо повышало их суммарную площадь по сравнению с крысами 2-й опытной группы и интактными животными (см. табл. 1, рис. 1). Такие митохондрии часто характеризовались крупными размерами и увеличенным числом крист (см. рис. 2, в), что может указывать на усиление их функциональной активности в продукции аденозинтрифосфата. Следовательно, в условиях радиации при воздействии МП НЧ развивалась только органоидная форма регенерации митохондрий (увеличивалась их численность) и ослаблялась внутриорганоидная (уменьшались размеры митохондрий и число крист). При применении ЭМИ СВЧ отчетливо активизировались обе формы регенерации митохондрий, что способствовало повышению их биоэнергетического потенциала. Эти структурные признаки усиления биоэнергетики в клетках Сертоли сочетались с активацией белоксинтезирующих органелл. В отдельных зонах цитоплазмы наблюдалась пролиферация новых мембран гранулярной эндоплазматической сети, а также гиперплазия рибосом и полисом. Возрастало число клеток Сертоли с высоким содержанием этих органелл, что особенно было заметно при воздействии ЭМИ СВЧ. Вместе с тем иногда встречались явления дегрануляции и фрагментации мембран гранулярной эндоплазматической сети, но значительно реже, чем в контроле. В отдельных клетках отмечалось расширение просветов цистерн как гранулярной, так и гладкой эндоплазматической сети. Таким образом, в клетках Сертоли под влиянием ЭМИ СВЧ в большей степени, чем при МП НЧ, возрастала численность функционально активных митохондрий и белоксинтезирующих органелл, при этом число клеток Сертоли повышалось только в виде тенденции.

В сперматогониях в связи с их делением и быстрым обновлением адаптационные сдвиги проявлялись в виде сочетания клеточной и внутриклеточной форм регенерации. Об усилении клеточной регенерации свидетельствовали достоверное увеличение количества сперматогоний и тенденция к восстановлению равновесия (баланса) между сперматогониями типов, А и В (табл. 2).

Таблица 2. Морфометрическая характеристика сперматогониев при воздействии ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиационного облучения Примечание. ⁺ — р<0,01 — по сравнению с 4-й группой; * — р<0,05, ** — р<0,01 — по сравнению с 3-й группой; ^o — р<0,01 — сравнение между 1-й и 2-й опытными группами.

Наиболее значительные сдвиги отмечались при воздействии ЭМИ СВЧ, при котором процентное соотношение между этими клетками приближалось к уровню интактных животных. Следовательно, развивались процессы восстановления численности резерва сперматогониев типа, А и повышения уровня дифференцировки сперматогониев типа В. Указанные изменения сопровождались снижением степени повреждений клеточных органелл и активацией процессов внутриклеточной регенерации, которые также были более выражены при воздействии ЭМИ СВЧ: число и размеры митохондрий увеличивались соответственно на 46,2% (р<0,01) и 38,2% (р<0,01), а их суммарная площадь возрастала в 2 раза (р<0,01) по сравнению с контролем и на 38,5% (р<0,01) по сравнению с влиянием МП НЧ (см. табл. 2). В отдельных сперматогониях типа В определялись участки цитоплазмы с пролиферирующей гранулярной эндоплазматической сетью, в сперматогониях типа, А возрастало число свободных рибосом и полисом (см. табл. 2), которые чаще распределялись диффузно по всей цитоплазме клеток. В целом интенсивность внутриклеточной регенерации в сперматогониях проявлялась слабее, чем в клетках Сертоли, более приспособленных к ней.

Таким образом, применение низкоинтенсивных ЭМИ СВЧ и МП НЧ ослабляло степень пострадиационных нарушений в клетках Сертоли и сперматогониях и усиливало развитие клеточной и внутриклеточной регенерации. Эти процессы в наибольшей степени были выражены при воздействии ЭМИ СВЧ. Характерными при этом являлись увеличение численности сперматогониев, улучшение состояния сбалансированности процессов регенерации между разными их типами, а также активация в них внутриклеточной регенерации. Более выраженное развитие внутриклеточной регенерации происходило в клетках Сертоли, особенно со стороны митохондрий, что не ограничивалось только увеличением числа этих органелл (как это происходило при воздействии МП НЧ), но и проявлялось в значительном усилении гиперплазии субмитохондриальных структур. Этот механизм, приводящий к нарастанию массы митохондрий, являлся, видимо, следствием повышенной функциональной активности клеток. Можно полагать, что реализация выявленных эффектов осуществлялась в основном через нейрогуморальные механизмы, в том числе через систему гипофиз—семенные канальцы [7], а также вследствие конформационных перестроек мембран клеток и внутриклеточных органелл, которые являются молекулярной основой антиоксидантного действия ЭМИ [8].

Заключение

Результаты проведенного исследования обосновывают возможность использования МП НЧ и особенно ЭМИ СВЧ для разработки перспективных лечебно-профилактических технологий в целях их использования в клинической практике при радиационной патологии.

Дополнительная информация

Источник финансирования: работа проведена при поддержке ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии» Минздрава России.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ю.К., И.Б.

Сбор и обработка материала — М.Г., Л.Н.

Статистическая обработка данных — М.Г., Л.Н., М.М.

Написание текста и редактирование — Ю.К.

Сведения об авторах

*Королев Юрий Николаевич, д.м.н., профессор [Yuri N. Korolev, MD, PhD, Professor]; адрес: Россия, 121099, Москва, ул. Новый aрбат, 32 [address: 32 Novy Arbat str., 121099 Moscow, Russia]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-5530-1538; eLibrary SPIN: 8071-8284; е-mail: korolev.yur.@yandex.ru

Бобровницкий Игорь Петрович, член-корр. РАН, д.м.н., профессор [Igor P. Bobrovnitskii, MD, PhD, Professor]; е-mail: 1ipb@mail.ru

Гениатулина Мариям Сабировна, к.б.н. [Mariyam S. Geniatulina, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-5263-0889;

е-mail: geniatulina.marina2012@yandex.ru

Михайлик Любовь Васильевна [Lubov V. Mikhailik]; ORCID: http://ocrid.org/0000-0002-9717-4749; е-mail: lyubovmihailic@yandex.ru

Никулина Людмила Анатольевна, к.б.н. [Liudmila A. Nikulina, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2200-868X;