Королев Ю.Н.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздравсоцразвития России, Москва

Бобровницкий И.П.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздрава РФ, Москва

Гениатулина М.С.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздравсоцразвития России, Москва

Никулина Л.А.

НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко РАМН, Москва

Михайлик Л.В.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздравсоцразвития России, Москва

Ультраструктура клеток Сертоли и сперматогониев при лечебно-профилактическом применении низкоинтенсивных электромагнитных излучений в условиях радиационного облучения крыс

Журнал: Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2018;95(1): 35‑40

Просмотров : 408

Загрузок : 3

Как цитировать

Королев Ю.Н., Бобровницкий И.П., Гениатулина М.С., Никулина Л.А., Михайлик Л.В. Ультраструктура клеток Сертоли и сперматогониев при лечебно-профилактическом применении низкоинтенсивных электромагнитных излучений в условиях радиационного облучения крыс. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2018;95(1):35‑40.
Korolev IuN, Bobrovnitskiĭ IP, Geniatulina MS, Nikulina LA, Mikhaĭlik LV. The ultrastructure of Sertoli cells and spermatogonia in the rats exposed to radiation under conditions of therapeutic and prophylactic application of low-intensity electromagnetic emission. Voprosy kurortologii, fizioterapii, i lechebnoi fizicheskoi kultury. 2018;95(1):35‑40. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/kurort201895135-40

Авторы:

Королев Ю.Н.

ФГБУ "Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии" Минздравсоцразвития России, Москва

Все авторы (5)

В различных экспериментальных исследованиях было установлено, что радиационное облучение оказывает негативное воздействие на процесс сперматогенеза. При этом в семенниках выявлялись нарушения микроциркуляции, клеточная и внутриклеточная дезинтеграции, выраженные деструктивные изменения клеток, вплоть до их гибели [1—3]. Предупредить или ослабить эти нарушения можно с помощью низкоинтенсивных электромагнитных излучений (ЭМИ), которые оказывают стимулирующее влияние на регенеративные и компенсаторно-приспособительные процессы в разных органах и функциональных системах. К ним относятся, в частности, низкоинтенсивное ЭМИ сверхвысокой частоты (СВЧ) и низкоинтенсивное магнитное поле (МП) низкой частоты (НЧ) [4]. Особый интерес представляет изучение ультраструктурных проявлений регенеративных процессов в таких различных по структуре и функции клетках, как сперматогонии, размножение которых составляет начальную фазу сперматогенеза, и клетки Сертоли, выполняющие важные функции по обеспечению различных этапов сперматогенеза. Следует отметить, что клетки Сертоли, являясь соматическими, имеют тесный контакт со сперматогониями, входят в состав их микроокружения и продуцируют факторы, необходимые для развития как сперматогониев, так и других половых клеток. При действии радиации эти клетки подвергаются деструктивным изменениям, особенно сперматогонии, которые подразделяются на типы, А (менее зрелые стволовые/прогениторные клетки) и В (более зрелые популяции клеток). Последние особенно чувствительны к воздействию радиации [5], что связано с их высокой митотической активностью. Можно предположить, что применение ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиации позволит активизировать развитие процессов регенерации и ослабить уровень деструктивных процессов в исследуемых клетках.

Цель исследования — выявить ультраструктурные нарушения в клетках Сертоли и сперматогониях в условиях радиации и изучить особенности их регенерации при лечебно-профилактическом применении низкоинтенсивных ЭМИ СВЧ и МП НЧ.

Материал и методы

Эксперименты были проведены на 28 полово-зрелых нелинейных крысах-самцах массой 180—220 г. Все крысы были разделены на четыре группы: 2 опытные, 1 контрольную и группу интактных животных. В 1-й опытной группе животных подвергали радиационному облучению с последующим воздействием низкоинтенсивным ЭМИ СВЧ; во 2-й опытной группе — радиационному облучению с последующим воздействием низкоинтенсивным МП НЧ; в 3-й группе (контроль) — только радиационному облучению; 4-ю группу составляли интактные крысы, которые никаким воздействиям не подвергались. Животных опытных и контрольной групп облучали с помощью аппарата «Агат-Р» гамма-лучами 60Со в дозе 2 Гр. Для электронно-микроскопических исследований семенники фиксировали в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,4), постфиксировали в 1% растворе OsO4. После обезвоживания образцы заключали в смесь эпон—аралдит. Исследование образцов производили с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Германия) с программой Carl Zeiss STM Nano Technology system Division, которая включает в себя математическую обработку внутриклеточных структур.

Работу проводили в лаборатории экспериментальных исследований отдела диагностических технологий ФГБУ НМИЦ Р.К. Минздрава России. Радиационное облучение животных осуществляли с помощью аппарата Агат-Р в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Лечебно-профилактические мероприятия начинали проводить через 3 нед (21 день) после радиационного облучения. Воздействие низкоинтенсивным ЭМИ СВЧ (на курс 10 процедур) проводили на поясничную область животных с помощью аппарата Акватон-02 (плотность потока мощности менее 1 мкВт/см2, частота около 1000 МГц, время воздействия 2 мин). Воздействие низкоинтенсивным МП НЧ также проводили на поясничную область с помощью аппарата МУМ-50 ЭДМА (постоянное и переменное МП 50 Гц с магнитной индукцией 35 мТл, время воздействия 2 мин). Забой животных осуществляли на следующий день после окончания процедур (через 1 мес после радиационного облучения).

Проводили морфометрический анализ митохондрий в клетках Сертоли и сперматогониях — оценивали количество, среднюю и суммарную площадь. Осуществляли подсчет клеток Сертоли, сперматогониев типов, А и В, а также числа этих клеток с различным содержанием рибосом и гранулярного эндоплазматического ретикулума.

Животные содержались в обычных условиях вивария и свободного доступа к воде и пище. Исследование осуществляли в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977) и требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986 г.).

Количественную оценку полученных данных проводили с помощью методов вариационной статистики. Для оценки достоверности различий сравниваемых средних величин использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты

Исследования показали, что через 1 мес после действия радиации у животных контрольной группы были выявлены отечность собственной оболочки семенных канальцев и очаги локального отека между клетками и базальной мембраной. В клетках Сертоли и сперматогониях были обнаружены нарушения со стороны различных субклеточных структур. Для клеток Сертоли характерными являлись дегрануляция и фрагментация гранулярной эндоплазматической сети, расширение просветов их цистерн, при слиянии которых образовывались крупные вакуоли; митохондрии уменьшались в размерах, отдельные из них подвергались деструкции, развивались псевдомиелиновые структуры из митохондрий, нарушались внутриклеточные контакты между различными органеллами. Общее число сперматогониев и сперматогониев типа, А было резко сниженным, что свидетельствовало о выраженном ослаблении их резерва, а число сперматогониев типа В, наоборот, становилось увеличенным, что приводило к выраженному дисбалансу в содержании этих клеток. Снижение числа сперматогониев типа А, по-видимому, было связано с их делением и переходом в более зрелый тип В. Эта реакция клеток по своей сущности являлась компенсаторно-приспособительной на деструктивные процессы в сперматогенном эпителии, особенно в сперматогониях типа В, которые, по данным литературы [6], практически полностью подвергались гибели при радиационном облучении в дозе 1 Гр. Поэтому можно полагать, что увеличенное число сперматогониев типа В являлось новой генерацией клеток, в которой замедлены (нарушены) процессы созревания и дифференцировки в гаплоидные клетки. При ультраструктурном анализе в сперматогониях разных типов были выявлены уменьшение содержания рибосом и полисом, расширение перинуклеарного пространства и просветов гранулярной эндоплазматической сети, дистрофические изменения отдельных митохондрий с локальными просветлениями матрикса. Таким образом, действие радиации приводило к ослаблению биосинтетических процессов в исследованных клетках, нарушению регенерации и снижению уровня компенсаторно-приспособительных реакций.

При применении низкоинтенсивных ЭМИ СВЧ и МП НЧ (1-я и 2-я опытные группы животных соответственно) явления деструкции и отека значительно ослаблялись, а процессы клеточной и внутриклеточной регенерации отчетливо усиливались. При этом обнаруживались характерные особенности в их развитии в зависимости от типа клеток и действующего фактора. Под влиянием МП НЧ в клетках Сертоли развивались процессы гиперплазии митохондрий, число которых увеличивалось на 57,7% (р<0,01) по сравнению с группой контроля (табл. 1, рис.

Таблица 1. Морфометрическая характеристика митохондрий клеток Сертоли при воздействии ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиационного облучения Примечание. + — р<0,01 — по сравнению с 4-й группой; * — р<0,01 — по сравнению с 3-й группой; o — р<0,01 — сравнение между 1-й и 2-й опытными группами.
1, 2,
Рис. 1. Морфометрическая характеристика митохондрий клеток Сертоли при радиационном облучении (контроль), воздействии МП НЧ и ЭМИ СВЧ. + — р<0,01 — по сравнению с интактной группой; * — р<0,01— по сравнению с контрольной группой; o — р<0,01 — сравнение между 1-й и 2-й опытными группами.
Рис. 2. Ультраструктура клеток Сертоли при радиационном облучении (контроль), воздействии ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиации. Ув. 20 000. а — радиационное облучение (контроль) — зона контакта клетки Сертоли и сперматогония (сп), явления отека неклеточного слоя (обозначено стрелкой) собственной оболочки семенного канальца, скопление жидкости между клетками и базальной мембраной (бм), формирование псевдомиелиновой структуры из митохондрий; б — восстановление структуры собственной оболочки семенного канальца, увеличение числа мелких митохондрий при воздействии МП НЧ; в — увеличение размеров митохондрий и числа крист при воздействии ЭМИ СВЧ.
а, б). Митохондрии становились более мелкими со сниженным числом крист. Средняя их площадь уменьшалась на 20% (р<0,01), однако суммарная площадь, наоборот, возрастала до уровня интактных животных за счет резкого увеличения численности митохондрий. При воздействии ЭМИ СВЧ в клетках Сертоли происходило статистически значимое увеличение как количества (на 34,3%; р<0,01), так и средней площади (на 20%; р<0,01) митохондрий, что отчетливо повышало их суммарную площадь по сравнению с крысами 2-й опытной группы и интактными животными (см. табл. 1, рис. 1). Такие митохондрии часто характеризовались крупными размерами и увеличенным числом крист (см. рис. 2, в), что может указывать на усиление их функциональной активности в продукции аденозинтрифосфата. Следовательно, в условиях радиации при воздействии МП НЧ развивалась только органоидная форма регенерации митохондрий (увеличивалась их численность) и ослаблялась внутриорганоидная (уменьшались размеры митохондрий и число крист). При применении ЭМИ СВЧ отчетливо активизировались обе формы регенерации митохондрий, что способствовало повышению их биоэнергетического потенциала. Эти структурные признаки усиления биоэнергетики в клетках Сертоли сочетались с активацией белоксинтезирующих органелл. В отдельных зонах цитоплазмы наблюдалась пролиферация новых мембран гранулярной эндоплазматической сети, а также гиперплазия рибосом и полисом. Возрастало число клеток Сертоли с высоким содержанием этих органелл, что особенно было заметно при воздействии ЭМИ СВЧ. Вместе с тем иногда встречались явления дегрануляции и фрагментации мембран гранулярной эндоплазматической сети, но значительно реже, чем в контроле. В отдельных клетках отмечалось расширение просветов цистерн как гранулярной, так и гладкой эндоплазматической сети. Таким образом, в клетках Сертоли под влиянием ЭМИ СВЧ в большей степени, чем при МП НЧ, возрастала численность функционально активных митохондрий и белоксинтезирующих органелл, при этом число клеток Сертоли повышалось только в виде тенденции.

В сперматогониях в связи с их делением и быстрым обновлением адаптационные сдвиги проявлялись в виде сочетания клеточной и внутриклеточной форм регенерации. Об усилении клеточной регенерации свидетельствовали достоверное увеличение количества сперматогоний и тенденция к восстановлению равновесия (баланса) между сперматогониями типов, А и В (табл. 2).

Таблица 2. Морфометрическая характеристика сперматогониев при воздействии ЭМИ СВЧ и МП НЧ в условиях радиационного облучения Примечание. + — р<0,01 — по сравнению с 4-й группой; * — р<0,05, ** — р<0,01 — по сравнению с 3-й группой; o — р<0,01 — сравнение между 1-й и 2-й опытными группами.
Наиболее значительные сдвиги отмечались при воздействии ЭМИ СВЧ, при котором процентное соотношение между этими клетками приближалось к уровню интактных животных. Следовательно, развивались процессы восстановления численности резерва сперматогониев типа, А и повышения уровня дифференцировки сперматогониев типа В. Указанные изменения сопровождались снижением степени повреждений клеточных органелл и активацией процессов внутриклеточной регенерации, которые также были более выражены при воздействии ЭМИ СВЧ: число и размеры митохондрий увеличивались соответственно на 46,2% (р<0,01) и 38,2% (р<0,01), а их суммарная площадь возрастала в 2 раза (р<0,01) по сравнению с контролем и на 38,5% (р<0,01) по сравнению с влиянием МП НЧ (см. табл. 2). В отдельных сперматогониях типа В определялись участки цитоплазмы с пролиферирующей гранулярной эндоплазматической сетью, в сперматогониях типа, А возрастало число свободных рибосом и полисом (см. табл. 2), которые чаще распределялись диффузно по всей цитоплазме клеток. В целом интенсивность внутриклеточной регенерации в сперматогониях проявлялась слабее, чем в клетках Сертоли, более приспособленных к ней.

Таким образом, применение низкоинтенсивных ЭМИ СВЧ и МП НЧ ослабляло степень пострадиационных нарушений в клетках Сертоли и сперматогониях и усиливало развитие клеточной и внутриклеточной регенерации. Эти процессы в наибольшей степени были выражены при воздействии ЭМИ СВЧ. Характерными при этом являлись увеличение численности сперматогониев, улучшение состояния сбалансированности процессов регенерации между разными их типами, а также активация в них внутриклеточной регенерации. Более выраженное развитие внутриклеточной регенерации происходило в клетках Сертоли, особенно со стороны митохондрий, что не ограничивалось только увеличением числа этих органелл (как это происходило при воздействии МП НЧ), но и проявлялось в значительном усилении гиперплазии субмитохондриальных структур. Этот механизм, приводящий к нарастанию массы митохондрий, являлся, видимо, следствием повышенной функциональной активности клеток. Можно полагать, что реализация выявленных эффектов осуществлялась в основном через нейрогуморальные механизмы, в том числе через систему гипофиз—семенные канальцы [7], а также вследствие конформационных перестроек мембран клеток и внутриклеточных органелл, которые являются молекулярной основой антиоксидантного действия ЭМИ [8].

Заключение

Результаты проведенного исследования обосновывают возможность использования МП НЧ и особенно ЭМИ СВЧ для разработки перспективных лечебно-профилактических технологий в целях их использования в клинической практике при радиационной патологии.

Дополнительная информация

Источник финансирования: работа проведена при поддержке ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии» Минздрава России.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ю.К., И.Б.

Сбор и обработка материала — М.Г., Л.Н.

Статистическая обработка данных — М.Г., Л.Н., М.М.

Написание текста и редактирование — Ю.К.

Сведения об авторах

*Королев Юрий Николаевич, д.м.н., профессор [Yuri N. Korolev, MD, PhD, Professor]; адрес: Россия, 121099, Москва, ул. Новый aрбат, 32 [address: 32 Novy Arbat str., 121099 Moscow, Russia]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-5530-1538; eLibrary SPIN: 8071-8284; е-mail: korolev.yur.@yandex.ru

Бобровницкий Игорь Петрович, член-корр. РАН, д.м.н., профессор [Igor P. Bobrovnitskii, MD, PhD, Professor]; е-mail: 1ipb@mail.ru

Гениатулина Мариям Сабировна, к.б.н. [Mariyam S. Geniatulina, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-5263-0889;

е-mail: geniatulina.marina2012@yandex.ru

Михайлик Любовь Васильевна [Lubov V. Mikhailik]; ORCID: http://ocrid.org/0000-0002-9717-4749; е-mail: lyubovmihailic@yandex.ru

Никулина Людмила Анатольевна, к.б.н. [Liudmila A. Nikulina, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2200-868X;

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail