Терехов И.В.

Медицинский институт ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет», Тула, Россия

Бондарь С.С.

Медицинский институт ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет», Тула, Россия

Хадарцев А.А.

ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет», Тула, Россия

Состояние рецепторзависимых сигнальных путей в агранулоцитах периферической крови реконвалесцентов внебольничной пневмонии под влиянием микроволнового излучения

Журнал: Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2016;93(3): 23-28

Просмотров : 136

Загрузок : 1

Как цитировать

Терехов И. В., Бондарь С. С., Хадарцев А. А. Состояние рецепторзависимых сигнальных путей в агранулоцитах периферической крови реконвалесцентов внебольничной пневмонии под влиянием микроволнового излучения. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2016;93(3):23-28.
Terekhov I V, Bondar’ S S, Khadartsev A A. The state of receptor-dependent signal pathways in the agranulocytes from the peripheral blood of the reconvalescent patients following community-acquired pneumonia under the influence of microwave radiation. Voprosy kurortologii, fizioterapii, i lechebnoi fizicheskoi kultury. 2016;93(3):23-28.
https://doi.org/10.17116/kurort2016323-28

Авторы:

Терехов И.В.

Медицинский институт ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет», Тула, Россия

Все авторы (3)

Цитокиновая сигнализация важна для аутокринной регуляции клеточной активности, поскольку она обеспечивает условия для межклеточного взаимодействия. При этом ответ клеточной системы на информационные сигналы, опосредуемые цитокинами, в значительной мере определяется состоянием JAK/STAT-сигнального пути [1—4]. В этом сигнальном пути связывание цитокина с соответствующим рецептором запускает механизм активации рецепторной протеинкиназы (JAK), фосфорилирующей цитоплазматические белки (STAT), образующие ядерные транскрипционные факторы [2, 4]. В качестве негативных регуляторов данного сигнального пути выступают белки, дефосфорилирующие JAK-киназы (SOCS-белки), а также протеины семейства PIAS, прерывающие проведение рецепторного сигнала внутрь клетки [5]. При этом SOCS-белки, в частности SOCS2, обеспечивают регуляцию как адаптивных иммунных реакций, регулируя дифференцировку и пролиферацию Т-хелперов, так и врожденных иммунных механизмов, ограничивая провоспалительную активацию антигенпрезентирующих клеток, а также натуральных киллеров (NK) [6—9].

Таким образом, состояние JAK/STAT-сигнального пути определяет эффективность процессов пролиферации, дифференцировки, роста, противовирусного ответа и т. д. Воздействие неблагоприятных экологических факторов зачастую сопровождается нарушением согласованного функционирования внутриклеточных молекулярных процессов, при котором наблюдается снижение их эффективности. Это создает предпосылки нарушения нормального клеточного функционирования, снижения клеточной резистентности, изменения реактивности, а также способствует преждевременной клеточной гибели. Перенесенная патология часто сопровождается нарушением функционирования внутриклеточных молекулярных процессов, затрудняя саногенез и регенерацию, что способствует хроническому течению и злокачественной трансформации.

В условиях воздействия на организм неблагоприятных факторов внешней среды особую значимость приобретает задача восстановления оптимального функционирования внутриклеточных молекулярных систем, в том числе путем восстановления естественных для живой системы молекулярно-волновых параметров водосодержащих сред, как первичной мишени воздействия ксенобиотиков [10, 11]. Решение этой проблемы зависит от поиска новых лечебных факторов, способных компенсировать отклонения внутриклеточного метаболизма.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют об иммуномодулирующем действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения в широком диапазоне частот сверхвысокочастотного (СВЧ) и крайневысокочастотного излучения [11—13]. Вместе с тем молекулярные внутриклеточные механизмы биологических эффектов данного физиотерапевтического фактора изучены недостаточно [12, 14].

Цель настоящего исследования — изучение биологических эффектов низкоинтенсивного СВЧ-излучения на состояние JAK/STAT-сигнального пути в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови реконвалесцентов внебольничной пневмонии (ВП).

Пациенты и методы

В соответствии с целью настоящей работы были обследованы 30 пациентов мужского пола с бактериальной ВП нетяжелого течения в стадии реконвалесценции (15—17-е сутки) в возрасте от 20 до 35 лет (основная группа). Контрольную группу составили 15 практически здоровых молодых человек из числа доноров крови в возрасте от 20 до 33 лет. Материалом для исследования служила венозная кровь, забиравшаяся в утренние часы (с 7:00 до 7:30) из локтевой вены. Путем разделения пробы крови на две части в каждой группе формировали две подгруппы. Первая подгруппа включала необлученные образцы крови, 2-я — образцы, подвергнутые СВЧ-облучению при плотности потока мощности 0,1 мкВт/см2.

Исследование эффектов СВЧ-облучения проводили с использованием набора реагентов Цитокин-Стимул-Бест (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Для проведения исследования 1 мл цельной крови вносили во флакон, содержащий 4 мл среды DMEM. Подготовленные таким образом образцы облучали в течение 45 мин аппаратом микроволновой терапии Акватон-02 (ООО «Телемак», Саратов) с частотой 1000±0,01 МГц (плотность потока энергии 50 нВт/см2). После облучения флаконы помещали на 24 ч в термостат при температуре 37 °С с последующим выделением мононуклеаров в градиенте плотности фиколл-верографина (ρ=1,077) и приготовлением лизатов по методике, рекомендованной производителем тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА). Для приготовления лизатов использовали 1 мл клеточной суспензии, содержащей 5×106 клеток. Подсчет клеток и анализ их жизнеспособности производили с использованием автоматического счетчика клеток TC20 («Biorad», США).

Внутриклеточный уровень общих форм киназ JAK1, JAK2 и JAK3, белков SOCS2, SOCS4, SOCS7, PIAS3, фосфорилированной по тирозину в положении 701 формы STAT1, в положении 705 формы STAT3, в положении 693 формы STAT4, в положении 694 формы STAT5B, в положении 641 формы STAT6 оценивали методом ИФА. При проведении исследований использовали соответствующие наборы CUSABIO BIOTECH (Китай). ИФА проводился на анализаторе Personal LAB («Adaltis Italia S.p.A.», Италия).

Статистическую обработку проводили с помощью программы Statistica 7.0. Статистическую значимость (р) межгрупповых различий для независимых выборок оценивали с помощью U-критерия Манна—Уитни, в случае парных сравнений использовали Т-критерий Вилкоксона.

Результаты

Результаты оценки внутриклеточной концентрации исследуемых факторов у практически здоровых лиц и реконвалесцентов ВП представлены в табл. 1.

Таблица 1. Внутриклеточная концентрация исследуемых факторов в группах (пг/мл) Примечание. Δ — различие концентрации исследованных факторов у реконвалесцентов ВП и практически здоровых лиц; х — среднее значение концентрации фактора; СКО — среднеквадратичное отклонение.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что культуры клеток реконвалесцентов ВП характеризуются максимальными различиями c культурами здоровых лиц по уровню STAT5B, JAK3, SOCS2 и PIAS3. При этом в группе контроля уровень STAT3, STAT4 и JAK1 выше, чем у реконвалесцентов В.П. Указанные обстоятельства свидетельствуют о сохранении у реконвалесцентов ВП молекулярных проявлений воспалительной реактивности [4, 13].

Анализ внутриклеточного содержания отдельных компонентов JAK/STAT-сигнальной системы указывает на преобладание среди всех исследованных компонентов внутриклеточной концентрации протеинкиназы JAK1. Ее уровень в мононуклеарах практически здоровых лиц в 2,19 раза (р=0,022) превышал концентрацию протеинкиназы JAK3, и в 10 раз — концентрацию JAK2 (р=0,00011). У реконвалесцентов ВП соответствующее превышение составляло 2 (р=0,022) и 9,75 (р=0,001) раза соответственно.

Из числа исследованных белков STAT наибольшим внутриклеточным содержанием в группе контроля отличается STAT6, наименьшим — STAT5B. При этом в мононуклеарах практически здоровых лиц концентрация STAT6 превышает уровень STAT3 в 1,49 раза (р=0,027), STAT1 — в 1,92 раза (р=0,021), STAT4 — в 2,19 раза (р=0,011), а STAT5B —в 3,3 раза (р=0,0022).

В мононуклеарах реконвалесцентов ВП концентрация STAT6, также как и у здоровых лиц, преобладает над другими STAT-белками. В данной группе уровень STAT6 превышал концентрацию STAT3 в 1,8 раза (р=0,027), STAT1 — в 1,86 раза (р=0,03), STAT5B — в 1,9 раза (р=0,02), а STAT4 — в 2,6 раза (р=0,0035).

Анализ полученных результатов свидетельствует о повышенном (8,0%) уровне киназы JAK3 (p < 0,05) у реконвалесцентов В.П. Кроме того, у таких пациентов отмечено повышение содержания белка STAT5B на 81,7% (p<0,005), а SOCS2 и PIAS3 — на 16,1% (p<0,001) и 72,7% (p<0,001) соответственно. На этом фоне наблюдалась тенденция к снижению внутриклеточной концентрации JAK2 на 0,4% (p<0,05), STAT3 — на 13,4% (p>0,1), STAT4 — на 10,3% (p>0,1).

Таким образом, в агранулоцитах цельной крови реконвалесцентов ВП имеет место активация сигнального пути, опосредуемого JAK3/STAT6/STAT5B, способствующая повышению эффективности рецепторной трансдукции сигналов от рецепторов интерлейкина-2, -4, -7, -9, -15 и -21 (семейства цитокинов, передающих сигнал посредством рецепторов с общей γ-цепью), определяющей изменение функционального состояния Т-, В- и NK-клеток. Существенное повышение у реконвалесцентов ВП внутриклеточного уровня STAT6, снижение активности STAT3 и STAT4, являющихся эссенциальными факторами дифференцировки Т-хелперов 1-го и 17-го типов, а также повышенный уровень ингибитора STAT3 — белка PIAS3 и супрессора цитокиновой сигнализации SOCS2 определяют формирование у реконвалесцентов ВП поляризации иммунного ответа по гуморальному типу с ограничением клеточно-опосредованной цитотоксичности и активности фагоцитоза.

Особенности биологических эффектов низкоинтенсивного СВЧ-облучения образцов цельной крови практически здоровых лиц и реконвалесцентов ВП представлены в табл. 2, 3.

Таблица 2. Влияние облучения на концентрацию исследуемых факторов в мононуклеарах практически здоровых лиц (пг/мл) Примечание. Δ — различие концентраций исследуемого фактора между облученной и необлученной культурой в группе контроля; х — среднее значение концентрации фактора; Ме — медиана; Q25 — 25-й процентиль; Q75 — 75-й процентиль.

Таблица 3. Влияние облучения на концентрацию исследуемых факторов в мононуклеарах реконвалесцентов ВП (пг/мл) Примечание. Δ — различие концентраций исследуемого фактора между облученной и необлученной культурой у больных ВП; х — среднее значение концентрации фактора; Ме — медиана; Q25 — 25-й процентиль; Q75 — 75-й процентиль.

Анализ биологических эффектов СВЧ-излучения культуры клеток крови здоровых лиц выявил его негативное влияние на уровень фосфорилированных форм STAT-факторов, максимально в отношении STAT5B. Отмечалось также снижение концентрации SOCS-белков, более выраженное в отношении SOCS7. На этом фоне в облученных культурах увеличилось содержание белков JAK и PIAS3.

Проведенный анализ биологических эффектов низкоинтенсивного СВЧ-облучения цельной крови реконвалесцентов ВП свидетельствует о снижении функциональной активности STAT-факторов под влиянием облучения. Наибольшее его влияние отмечается в отношении STAT4, уровень которого в облученных культурах в сравнении с контрольными образцами снизился на 75,5‰.

Таким образом, низкоинтенсивное СВЧ-облучение культуры клеток крови реконвалесцентов ВП в большой мере способствует снижению доли активных форм STAT-белков, входящих в состав транскрипционных факторов. При этом СВЧ-излучение способствует нормализации уровней STAT1 и STAT6, а также приближению уровня STAT5B к значениям здоровых лиц. Вместе с тем данное воздействие сопровождается дальнейшим снижением внутриклеточной концентрации фосфоформ STAT3 и STAT4, уровень которых у реконвалесцентов ВП после облучения в сравнении с исходным уровнем в группе контроля снизился на 19,6% (p<0,05) и 16,1% (p<0,05) соответственно.

Облучение культуры клеток цельной крови реконвалесцентов ВП способствует приближению внутриклеточной концентрации STAT5B к его уровню у практически здоровых лиц на 15,5%, JAK1 — на 27,3%, SOCS2 —на 2,2%, SOCS4 — на 3,9%, SOCS7 — на 4,7%. Уровни STAT1 и STAT6 под влиянием облучения культур клеток цельной крови реконвалесцентов ВП приближались к уровню необлученных образцов группы контроля на 93,6 и 90,0% соответственно, что практически соответствует уровню здоровых лиц. Характер наблюдаемых биологических эффектов облучения позволяет говорить о тенденции к нормализации внутриклеточной концентрации исследованных факторов в мононуклеарах реконвалесцентов ВП под воздействием излучения.

Приближение концентрации исследованных факторов к уровню практически здоровых лиц, в частности STAT6, создает условия для нормализации реактивности Т-хелперов 2-го типа, а нормализация уровня STAT1, регулирующего экспрессию генов интерферонов I и II типа, способствует также восстановлению реактивности цитотоксических клеток [15—17]. Динамика внутриклеточного содержания STAT5B говорит о тенденции к нормализации у реконвалесцентов ВП под влиянием облучения и пролиферативной активации гемопоэтических клеток [4, 16].

Однократное низкоинтенсивное СВЧ-воздействие на культуру клеток цельной крови способствует усилению различий между здоровыми лицами и реконвалесцентами ВП по внутриклеточному содержанию отдельных факторов. Так, под влиянием облучения в группе реконвалесцентов ВП отмечено более выраженное, чем в контроле, снижение факторов STAT3 и STAT4 (44,8 и 74,0% соответственно). Таким образом, у реконвалесцентов ВП в сравнении с практически здоровыми лицами облучение приводило к более выраженному дефосфорилированию STAT4, эссенциального фактора дифференцировки Т-хелперов 1-го типа, обеспечивающего экспрессию генов интерферона-γ, фактора некроза опухоли-α, а также генов цитокиновых рецепторов, в частности интерлейкина-12 и -18 [17—19]. В сравнении с предыдущим фактором СВЧ-облучение в меньшей степени снижает концентрацию STAT3, являющегося одним из эссенциальных факторов дифференцировки T-хелперов 17-го типа [19]. Вместе с тем уровень селективного ингибитора активности STAT3 — протеина PIAS3 под влиянием облучения в культуре клеток реконвалесцентов ВП в сравнении со здоровыми лицами возрос на 60%, определяя угнетение активности STAT3 и снижение экспрессии контролируемых им генов [2, 3, 5, 19].

В облученных культурах реконвалесцентов ВП в сравнении со здоровыми лицами уровень JAK2 и JAK3 был повышен на 45,5 и 3,2% соответственно. Таким образом, изучаемое физическое воздействие способствует повышению эффективности передачи рецепторного сигнала от молекулы цитокинов и факторов роста внутрь клетки.

Выявлена тенденция к снижению в облученных культурах реконвалесцентов ВП внутриклеточной концентрации супрессоров цитокиновой сигнализации до уровня здоровых лиц. Повышение внутриклеточного уровня в мононуклеарах обследованных пациентов белка SOCS2, а также других изучаемых факторов JAK/STAT-сигнального пути определяет сохранение у реконвалесцентов ВП высокой реактивности мононуклеаров цельной крови. Снижение внутриклеточной концентрации SOCS-белков в облученных культурах свидетельствует об иммуномодулирующем действии низкоинтенсивного СВЧ-излучения, приводящем к снижению клеточной реактивности и приближению ее к уровню здоровых лиц [4, 19].

Выводы

1. Фаза реконвалесценции патологических изменений у больных ВП протекает на фоне измененной функциональной активности JAK/STAT-сигнального пути, проявляющейся статистически значимым повышением внутриклеточного содержания в мононуклеарах цельной крови JAK3, STAT5B, SOCS2, а также тенденцией к снижению уровня STAT3, STAT4 и JAK1.

2. Однократное облучение культуры клеток цельной крови реконвалесцентов ВП излучением частотой 1000 МГц, плотностью потока мощности 50 нВт/см2 сопровождается нормализацией концентрации в мононуклеарах STAT1 и STAT6, приближением к уровню здоровых лиц внутриклеточного содержания фосфорилированной по тирозину в положении 694 формы STAT5B, JAK1, SOCS2, SOCS4 и SOCS7. Под влиянием облучения у больных ВП отмечено снижение концентрации фосфорилированных по тирозину в положении 705 и 693 форм STAT3 и STAT4 соответственно и повышение концентрации протеина PIAS3.

3. Установлено иммуномодулирующее действие низкоинтенсивного СВЧ-излучения, проявляющееся ускорением нормализации активности JAK/STAT-сигнального пути у реконвалесцентов ВП.

4. Низкоинтенсивное излучение частотой 1000 МГц — дополнительный фактор медицинской реабилитации пациентов, перенесших ВП, нормализующий реактивность иммунокомпетентных клеток и активирующий саногенез.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Х.

Сбор и обработка материалов: С.Б.

Статистическая обработка данных, написание текста: И.Т.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail