Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) давно привлекают внимание исследователей и практических врачей с точки зрения их возможного использования для заместительной или восстановительной терапии заболеваний, генной или клеточной инженерии [1].

МСК - мультипотентные стромальные клетки, способны к дифференцировке в различные типы клеток тканей - остеобласты, хондроциты, адипоциты, миобласты, гепатоциты, кардиомиоциты и др. [1-3]. МСК человека сохраняют способность к пролиферации и дифференцировке при культивировании in vitro, а также при реимплантации, что обусловливает их высокую значимость в клинической практике [1]. Есть данные о возможности получения из МСК нейрональных предшественников с последующей дифференцировкой их в клетки нервной ткани (нейроны, астроциты, олигодендроциты) [4-7]. Известно, что МСК секретируют почти все основные провоспалительные цитокины и ростовые факторы [2].

Если будут найдены условия для расширения мультипотентности мезенхимальных стволовых клеток до плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток, в регенеративно-пластической медицине автоматически разрешатся многие проблемы этического, морального, религиозного и юридического характера. Одним из известных способов неспецифического регулирования клеточной активности МСК на этапе предварительного культивирования in vitro является воздействие низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ). Для чего использовали лазерные источники разной длины волны, работающие в основном в непрерывном режиме (табл. 1).

Использовали практически только непрерывные лазеры в широком диапазоне длин волн и экспозиций, при этом средняя мощность и плотность мощности (ПМ) чаще всего минимальны. Итоговая энергетическая плотность (ЭП) находится в достаточно узких пределах, характерных для эффектов, наблюдаемых в других типах клеток [8], хотя сама по себе ЭП (или так называемая доза) абсолютно неинформативна, а важнейшие параметры методики воздействия часто не указываются [9, 10].

Имеются также данные в отношении других стволовых клеток и физических факторов, в частности F. Eduardo и соавт. [26] показали, что стволовые клетки пульпы зубов человека (hDPSC) положительно реагируют на лазерное освечивание (длина волны 660 нм, мощность 20 мВт, экспозиция 6 с), усиливается клеточный рост и повышается жизнеспособность клеток, но только когда их культивируют в условиях питательного дефицита. Акустические импульсы увеличивают пролиферативную активность ослабленных МСК человека на 80%. Синергизма в усилении пролиферации при комбинировании с низкоинтенсивным КВЧ-излучением (длина волны 7,1 мм) обнаружено не было [27].

Из таблицы видно, насколько разнообразны получаемые эффекты, но все они кальцийзависимые, поскольку первичным механизмом стимуляции клеточной активности (физиологии) является термодинамический запуск Ca²⁺-зависимых процессов [28]. Также известно, что при увеличении внутриклеточного кальция снижается вероятность гибели по механизму апоптоза и повышается выживаемость эмбриональных стволовых клеток in vitro [29], МСК in vivo [30].

В отношении возможного влияния некогерентного света на МСК данные противоречивые. Установлено почти 2-кратное увеличение пролиферации МСК in vitro после освечивания широкополосным светом (ЭП 2,4-7,2 Дж/см²) [31]. Некогерентный свет (светоизлучающие диоды, СИД) (ЭП 2-4 Дж/см²) не влияет на остеогенную дифференцировку МСК в норме, но усиливает дифференцировку и уменьшает пролиферацию в средах с остеогенными добавками [32]. Наша точка зрения в отношении некогерентных источников однозначна - бесполезны, необходимо использовать только лазерный монохроматический свет для эффективного воздействия, получения максимального отклика биологических систем разного уровня организации [8].

Также показано, что после одного воздействия наблюдается лишь кратковременное повышение пролиферации (630 нм, 15 мВт/см², ЭП 4 Дж/см²), эффект усиливается после многократного освечивания и при низкой плотности клеток [33]. Это подтверждает известный факт необходимости ежедневного 3-5-кратного повторного освечивания с целью накопления эффекта [8].

Не проведено ни одного исследования с применением импульсных лазеров, наиболее распространенных в современной лазерной терапии (длительность светового импульса 10^-7 с, импульсная мощность 5-10 Вт, длина волны 635 и 904 нм), хотя во многих публикациях показана их высокая эффективность как in vitro, так и in vivo [8, 34]. Не изучались перспективные возможности частотной модуляции.

В задачи нашего исследования входила оценка влияния импульсного НИЛИ инфракрасного (904 нм) и красного (635 нм) спектров, в том числе с использованием многочастотного режима, на морфологию, жизнеспособность, пролиферативную активность и скорость роста МСК in vitro.

Культура клеток. В эксперименте использовалась адгезивная культура МСК, 4 пассажа, полученных из ткани пуповины донора, давшего информированное согласие. Забор, транспортировка и обработка материала проводились в течение 24 ч с момента родов. МСК получены методом эксплантов с последующим культивированием фрагментов.

Культивирование проводили в течение 6 сут, с использованием стандартных питательных сред: Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification with NaHCO3 («Sigma-Aldrich», Германия), 2 mM L-глютамина («ПанЭко», Россия), 10% сыворотки плодов коровы (MSC FBS, Gibco, Австралия). Культивирование проводилось на чашках Петри площадью 11,78 см² (EasyGrip, «Beckton Dickinson», США). Также использовались: раствор Дальбекко (DPBS, «Биолот», Россия), раствор трипсина-ЭДТА («ПанЭко», Россия), центрифужные пробирки объемом 50 мл (CentriStar, «Corning Inc.», Мексика) и серологические пипетки объемом 25 и 10 мл (Falcon, «Beckton Dickinson», США).

Жизнеспособность клеток (отношение живых к мертвым) оценивали автоматически на анализаторе клеток Vi-Cell XR («Beckman Coulter», США).

Исследование проводилось в пяти группах, при трех чашках (повторениях) в каждой группе. Опытные группы освечивались НИЛИ (параметры представлены в табл. 2), время экспозиции 5 мин на 1 чашку.

Чашки диаметром 3,5 см полностью находились в световом поле (рис. 1), и на них приходилось соответственно ≈10% падающей световой энергии.

Непосредственно перед освечиванием МСК были инокулированы в количестве 3,7·10³ живых клеток/см² поверхности культуральной посуды в каждую чашку Петри исследуемых и контрольной групп. Дальнейшее культивирование осуществлялось при +37 °С, CO2 5% в течение пяти дней. Визуальное наблюдение за морфологией и ростом культуры проводилось ежедневно методом световой микроскопии до достижения монослоя в одной из групп. После этого был проведен подсчет общего количества клеток в каждой группе. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы SigmaPlot version 11.0.

Начиная с первого дня культивирования на всех исследуемых посудах можно было наблюдать клетки, находящиеся на разных стадиях деления (рис. 2).

При дальнейшем культивировании отмечался относительно равномерный рост культуры по всей поверхности пластика. Значимых изменений в морфологии клеток среди изучаемых и контрольной групп выявлено не было. На 5-й день культивирования морфологическая картина не изменилась и являлась типичной для культуры МСК. Межклеточные контакты плотные, клетки достигают монослоя во всех группах. Анализ диаметра клеток показал отсутствие разницы в размерах клеток в разных группах и во все дни культивирования.

Таким образом, морфологический анализ не выявил различий в морфологии клеток между контрольной и экспериментальными группами в процессе культивирования. Жизнеспособность в группах также не различалась.

С 1-го по 5-й день культивирования количество клеток в поле зрения оценивалось визуально с учетом показателя процент монослоя на поверхности культуральной посуды. Подсчет клеток проводили как в ручном, так и в автоматическом режиме. На рис. 3 представлено количество клеток в поле зрения через сутки после освечивания.

Оценка монослоя (площадь, занимаемая клетками) визуально проводилась в течение пяти суток культивирования (рис. 4).

Из представленных графиков, к сожалению, невозможно сделать однозначный вывод в пользу того или иного режима, поскольку исследование носило предварительный, оценочный характер, а для оптимизации параметров воздействия необходима большая детализация режимов и их комбинаций.

На наш взгляд, также перспективно рассматривать результаты предварительного освечивания in vitro как часть комплексной программы по конечному результату возможного приживления и нужной дифференцировки. Способность НИЛИ стимулировать пролиферацию клеток [36] и производство ангиогенных факторов, таких как васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) [37], предполагает возможность создания среды, которая является оптимальной для роста стволовых клеток in vivo [38]. Уже есть несколько работ, в которых проводили освечивание НИЛИ уже после пересадки МСК в различные ткани (табл. 3).

В пользу необходимости последовательного варианта лазерного воздействия могут свидетельствовать положительные результаты технологии имплантации эмбриональных нервных клеток в полностью рассеченный спинной мозг с последующим освечиванием НИЛИ (780 нм, 100 мВт, 30 мин) участка регенерации, когда намного лучшие результаты достигались после предварительного лазерного освечивания культуры клеток (780 нм, 50 мВт, 1 мин) [43, 44]. По аналогии можно было бы предположить, что и с МСК лучше было бы проводить предварительное освечивание на этапе культивирования, а затем после их пересадки.

Но даже без этого местное воздействие лазерным светом позволяет получить положительные результаты. Воздействие импульсным ИК НИЛИ (длина волны 890 нм, импульсная мощность 10 Вт, частота 150 Гц, экспозиция 5 мин, 7 ежедневных воздействий) чрескожно на область сердца экспериментальных крыс Вистар и системное введение аутологичных МСК, полученных культивированием клеток костного мозга, повышает пролиферативную активность клеток стромы, полнокровие мышцы сердца, усиливает ангиогенез, активизирует процессы репаративной регенерации миокарда [45]. Накопленные в настоящее время данные актуализируют научные исследования по выявлению специфических механизмов влияния НИЛИ на скорость миграции, пролиферативную активность и дифференцировку стволовых клеток, повышение физиологической устойчивости и жизнеспособности стволовых клеток при их трансплантации, индукцию выработки факторов роста, что позволит в полной мере использовать регенераторный потенциал лазерного излучения [46].

Результаты предварительного изучения возможного влияния импульсного НИЛИ инфракрасного (904 нм) и красного (635 нм) спектров, в том числе с использованием многочастотного режима Лазмик, на морфологию, жизнеспособность, пролиферативную активность и скорость роста мезенхимальных стволовых клеток in vitro показали, что при используемых энергетических и временных параметрах воздействия их морфология и жизнеспособность не меняется.

В то же время наблюдалось небольшое превышение количества клеток относительно контроля, лучший эффект после освечивания инфракрасным (904 нм) импульсным НИЛИ в режиме многочастотной модуляции Лазмик [8]. Эффект проявлялся в наибольшей степени в период с 1-го по 3-й день культивирования.

Необходимо проведение дополнительных исследований для оптимизации параметров воздействия (длина волны, мощность, время и пр.) с возможным расширением методики с освечиванием МСК не только предварительно, в культуре, но также после имплантации in vivo.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция, дизайн и редактирование: С.М., Д.К.

Сбор и обработка материала, статистическая обработка данных: С.М., Д.К., Е.А., С.В., О.К.

Написание текста: С.М.