Особое внимание в современных исследованиях эффектов электромагнитного излучения крайне высоких частот (ЭМИ КВЧ) уделяется их антиноцицептивному действию. Это объясняется тем, что данный эффект крайне востребован при лечении различных болевых синдромов, особенно когда применение фармацевтических средств ограничено по различным причинам.
Кожа чаще всего является первичной мишенью миллиметровых волн при их терапевтическом использовании, а, следовательно, основные эффекты ЭМИ КВЧ начинают реализовываться именно в этом органе. При КВЧ-облучении основные изменения происходят в поверхностных структурах кожи, прежде всего в рецепторах, тучных клетках, нервных проводниках [1, 2]. Наиболее подходящими структурными образованиями кожи для рецепции электромагнитных колебаний КВЧ низкой интенсивности считаются тельца Руффини, которые относятся к медленно адаптирующимся рецепторам, чувствительным к механическим и холодовым стимулам [3]. Активация данного типа рецепторов при КВЧ-воздействии может происходить благодаря изменению электрического статуса коллагеновых волокон, входящих в состав их капсулы. При этом значительный эффект последействия в данном случае объясняется электретными свойствами коллагена и его гидратной оболочки [4].
Однако антиноцицептивный эффект ЭМИ КВЧ может быть опосредован не только прямым влиянием на кожные рецепторы в зоне экспозиции. Так, со стороны нервной системы эффекты ЭМИ КВЧ определяются изменением активности кожных рецепторов [5] и облегчением токов К+, Na+, Са2+ в нейронах [6, 7].
Активирующее влияние ЭМИ КВЧ на иммунную и эндокринную функцию предполагает изменение активности системных регуляторных пептидов, прежде всего цитокинов [8—10]. Особое положение среди таких веществ занимает интерлейкин-6 (ИЛ-6). Этот цитокин обладает широким спектром действия при различных патологических состояниях, сопровождающихся воспалением (травмы, ишемия, ожоги, злокачественные опухоли, воздействия ядов, инфекции и аутоиммунные заболевания) [11].
Другой возможной биологической мишенью миллиметровых волн, на наш взгляд, может являться эндогенная каннабиноидная система. Такое предположение имеет несколько причин. Во-первых, как синтез, так и рецепторы эндоканнабиноидов локализованы на клеточной мембране — одной из основных мишеней нетеплового действия миллиметровых волн [12, 13]. Во-вторых, в отличие от «классических» медиаторов основные эндогенные каннабиноиды — арахидоноилэтаноламид (анандамид) и 2-арахидоноилглицерин (2-ГК) — синтезируются из своего прекурсора (арахидоновой кислоты) по мере надобности. При этом их концентрация в тканях может значительно возрастать за короткое время, что может объяснить эффекты ЭМИ КВЧ, проявляющиеся на первых этапах воздействия [12].
Таким образом, обширные сведения о механизмах формирования антиноцицептивного эффекта ЭМИ КВЧ, описанные в литературе, свидетельствуют об огромном интересе исследователей к данному вопросу. Тем не менее в современных исследованиях мало внимания уделяется изучению функциональных изменений в коже и периферических нервах при действии ЭМИ КВЧ. Между тем, на наш взгляд, исследования влияния ЭМИ миллиметрового диапазона на кожную рецепцию и электрическую активность периферических соматических нервов являются особенно важными, так как эти структуры могут во многом определять его антиноцицептивное действие.
Эксперименты проводились на 87 белых крысах-самцах. Экспериментальное КВЧ-облучение проводили с помощью аппарата КВЧ-НД. Параметры излучения: длина волны 7,1 мм (соответствует частоте 42,19 ГГц), тип излучения — непрерывное, время облучения 10 мин. Облучению подвергали кожу верхней части стопы животного в области рецептивного поля n. saphenus.
В острых электрофизиологических экспериментах у крыс, наркотизированных тиопенталом натрия (70 мг/кг), регистрировали тоническую афферентную импульсацию в подкожном нерве бедра (n. saphenus). Все опыты данной серии проводились на стандартной электрофизиологической установке для регистрации суммарной электрической активности нервов и нервных волокон. Животных помещали в термокамеру с постоянной температурой 29 °С. Им производилось вскрытие медиальной поверхности бедра с последующим препарированием n.saphenus. Отпрепарированный нерв клали на лигатуру и перерезали. Периферический конец нерва помещали на подвесной биполярный хлорсеребряный электрод и покрывали смесью вазелинового масла и парафина для предотвращения пересыхания.
Регистрацию и анализ полученных данных проводили с помощью программы InputWin, разработанной в Институте физиологии НАН Беларуси [14]. В качестве контроля в течение 20 мин регистрировали фоновую электрическую активность нерва до экспериментальных воздействий. После них изучаемый параметр регистрировали в течение часа.
При изучении изменения активности различных типов кожных рецепторов в ответ на КВЧ-облучение оценка чувствительности соответствующих рецепторов к дозированному специфическому стимулу, применяемому к области экспозиции ЭМИ КВЧ в течение 1 мин, проводилась до и после 10-минутного КВЧ-облучения. При регистрации активности терморецепторов использовалась вода со льдом (температура 0 °С, температура на поверхности кожи составляла 12 °С) для холодовых рецепторов и кипяток (температура 95 °C, температура на поверхности кожи составляла 41 °С) для тепловых рецепторов. При этом емкость с водой в обоих случаях находилась на расстоянии 1—2 мм от поверхности кожи во избежание ее травмирования и вовлечения механорецепторов и ноцицепторов в формирование афферентной импульсации в n. saphenus.
В случае регистрации активности механорецепторов в качестве стимула использовался миниатюрный зажим (давление 0,8 г/см2). Давление на кожу между браншами зажима не вызывало вокализации и ноцицептивной двигательной реакции у бодрствующего животного.
Уровень болевой чувствительности оценивался с помощью теста «горячей пластинки» («hot-plate»). Данный тест является общепринятой моделью исследования аналгезии и позволяет исследовать изменения ноцицептивной чувствительности практически на пороговом уровне [15]. Во время эксперимента животное помещали в специальную камеру на «горячую пластинку» с температурой 48 °C. Ноцицептивной реакцией считалось облизывание животным задней конечности. Порог ноцицепции оценивался на основании зарегистрированной величины латентного периода ноцицептивной реакции (ЛПНР) на тепловой ноцицептивный немеханический стимул. Оценка ЛПНР в каждом эксперименте проводилась до и после исследуемого воздействия. Контрольная группа животных получала инъекцию растворителя используемых веществ и/или имитацию КВЧ-облучения.
При изучении роли эндоканнабиноидов в формировании антиноцицептивного эффекта ЭМИ КВЧ использовались инъекционные растворы эндогенного агониста каннабиноидных рецепторов арахидоноилэтаноламида, или анандамида (АЕА), и неселективного блокатора двух типов каннабиноидных рецепторов АМ 281. В обоих случаях массовая концентрация действующего вещества составляла 25 мкг/мл. Кроме того, в состав обоих растворов входили: Твин-80 — 10%, этиловый спирт — 10%, физиологический раствор — 80%. Оба раствора вводились подкожно в медиальную часть стопы в объеме, соответствующем дозе действующего вещества 25 мкг/кг. В контрольных экспериментах использовался аналогичный раствор в соответствующем объеме, не содержащий каннабиноидов.
Для определения содержания в сыворотке крови крыс интерлейкина-6 (ИЛ-6) использовалась стандартная методика иммуноферментного анализа. Учитывая важную роль ИЛ-6 в регуляции процессов воспаления, уровень данного цитокина анализировался как в норме, так и при системном воспалении, вызванном липополисахаридом E. coli (ЛПС). В 1-й группе животные получали внутрибрюшинную инъекцию ЛПС в дозе 100 мкг/кг и имитацию КВЧ-воздействия. 2-я группа перед забором крови получала инъекцию апирогенного физиологического раствора и воздействие ЭМИ КВЧ. Животные 3-й группы получали внутрибрюшинную инъекцию ЛПС в дозе 100 мкг/кг и подвергались облучению ЭМИ КВЧ. Для развития лихорадочного ответа облучение ЭМИ КВЧ или его имитация проводились через час после инъекции. Сразу после завершения КВЧ-облучения проводилась декапитация животных для забора крови. Анализ полученных проб на уровень содержания ИЛ-6 проводился с помощью набора Rat OptEIA IL-6 Kit фирмы «Beckton & Dickenson» (США).
Статистическую обработку материала и построение графиков проводили с использованием программ Microsoft Office Excel 2003 и OriginPro 7.0.
О достоверности межгрупповых различий судили по t-критерию Стьюдента.
На первом этапе работы исследовалось действие ЭМИ КВЧ на рецепторную функцию кожи. В экспериментах данного этапа ставилась задача установить, каким образом ЭМИ КВЧ изменяет механическую, температурную и болевую чувствительность. Кроме того, в отдельных опытах проверялась гипотеза о возможном участии эндоканнабиноидов в реализации антиноцицептивного эффекта данного физического фактора.
Облучение стопы крысы ЭМИ КВЧ при действии тактильного стимула сопровождалось значительным снижением частоты афферентной импульсации в n. saphenus(рис. 1, а).
Интенсивность афферентной импульсации в n. saphenus в ответ на холодовой стимул после 10-минутного КВЧ-облучения по сравнению с контролем также уменьшалась (см. рис. 1, б). Наблюдалось уменьшение частоты вызванных потенциалов на протяжении всего периода применения холодового стимула (60 с).
При тепловом воздействии облучение ЭМИ КВЧ также приводило к видимому уменьшению частоты центростремительной импульсации (см. рис. 1, в).
Таким образом, воздействие ЭМИ КВЧ длиной волны 7,1 мм вызывало ослабление кожной рецепции трех типов: тактильной, холодовой и тепловой. Учитывая универсальное действие ЭМИ КВЧ на работу кожных рецепторов различной модальности, можно предположить, что наблюдаемые эффекты опосредованы значительными изменениями в облучаемой ткани, возможно, выделением различных биологически активных веществ.
В следующей части работы исследовалось влияние ЭМИ КВЧ на ЛПНР в норме и на фоне инъекции АЕА или АМ 281. Облучение медиальной поверхности стопы крысы ЭМИ КВЧ (рис. 2, а)
В следующей серии электрофизиологических экспериментов изучалось влияние ЭМИ КВЧ на тоническую афферентную активность n. saphenus в норме. В двух последующих сериях опытов тоническая афферентная активность n. saphenus регистрировалась до и после КВЧ-облучения на фоне действия агониста АЕА, и антагониста (АМ 281) каннабиноидных рецепторов. Общей задачей данного этапа исследования было сравнение изменений указанного параметра в ответ на действия ЭМИ КВЧ и лигандов каннабиноидных рецепторов, выяснение электрофизиологических механизмов действия данного физического фактора на болевую чувствительность и роли эндоканнабиноидной системы в реализации его антиноцицептивного эффекта. Во всех этих экспериментах фоновая тоническая импульсация составляла в среднем 29,2±0,8 имп/с и достоверно не изменялась в течение 20 мин (рис. 3).
Облучение стопы крысы ЭМИ КВЧ вызывало уменьшение электрической активности афферентных проводников, следующих в составе n. saphenus, начиная с 5-й минуты после облучения (см. рис. 3, а). Далее понижение частоты афферентных импульсов приобретало более плавный характер. Достоверные изменения изучаемого параметра выявлялись уже на 10-й минуте после облучения. Максимальных значений изменения достигали к 50-й минуте после облучения и составляли 23,36±1,2 имп/с, что на 20% ниже уровня фона. До конца периода регистрации частота импульсов продолжала снижаться.
В опытах, где изучалось влияние ЭМИ КВЧ на афферентную импульсацию в подкожном нерве бедра на фоне инъекции АЕА (см. рис. 3, б), через 5 мин после инъекции эндоканнабиноида и в течение 20 последующих мин регистрируемый параметр был достоверно (р<0,05) ниже фоновых значений и составил в среднем 25,1±1,4 имп/с (в среднем на 17% ниже). В то же время после 10 мин облучения ЭМИ КВЧ длиной волны 7,1 мм частота афферентной импульсации в указанном нерве продолжала снижаться. Достоверными отличия становились через 15 мин после завершения КВЧ-воздействия. Максимальное снижение центростремительной импульсации в n. saphenus отмечалось на 45-й минуте после завершения КВЧ-воздействия и составляло 11,2±1,6 имп/с, что более чем на 55% ниже среднего значения после инъекции АЕА и приблизительно на 63% ниже фоновых показателей.
Сравнивая действие ЭМИ КВЧ длиной волны 7,1 мм на афферентную импульсацию в n. saphenus и его действие на фоне инъекции АЕА, можно отметить, что совместный эффект данных факторов выражен гораздо сильнее, чем суммация отдельных эффектов.
На наш взгляд, взаимное усиление эффектов двух разных факторов можно объяснить вовлеченностью АЕА в механизмы реализации эффектов ЭМИ КВЧ. Возможно, действие ЭМИ КВЧ увеличивает сродство АЕА к специфическим рецепторам, что и приводит к наблюдаемому эффекту. Другим предположительным механизмом может являться дополнительное выделение АЕА из клеток под действием миллиметрового излучения. Можно также говорить о суммации однонаправленных физиологических эффектов, вызванных различными факторами.
После подкожной инъекции АМ 281 наблюдалось значительное увеличение частоты афферентной импульсации (см. рис. 3, в). Максимум афферентной импульсации приходился на 30-ю минуту и составлял 47,3±2,3 имп/с (что на 59% больше фоновых значений). В то же время после облучения ЭМИ КВЧ с длиной волны 7,1 мм регистрируемый параметр начинал снижаться через 5—15 мин после завершения воздействия. Через 25 мин после завершения КВЧ-облучения уровень афферентной импульсации в n. saphenus был достоверно (р<0,05) ниже значений, наблюдаемых после инъекции АМ 281 и приблизительно соответствовал значениям фона.
К 30-й минуте после облучения частота афферентной импульсации опустилась достоверно (р<0,01) ниже фоновых значений и продолжала снижаться. Минимальных значений регистрируемый параметр достиг к 55-й минуте после облучения и составил 11,5±1,3 имп/с, что в среднем на 61% ниже фоновых значений и на 76% ниже максимальных значений после введения АМ 281.
Таким образом, несмотря на значительное повышение афферентной импульсации в n. saphenus после инъекции АМ 281, вызванное, по-видимому, блокадой каннабиноидных рецепторов, ЭМИ КВЧ приводило не только к нивелированию этого повышения, но и к дальнейшему снижению регистрируемого параметра.
Следовательно, результаты данной серии экспериментов не подтверждают предположения о ведущей роли эндоканнабиноидной системы в реализации эффекта ЭМИ КВЧ на афферентную импульсацию в n.saphenus. Полученные данные, однако, не свидетельствуют о том, что эндоканнабиноиды вовсе не вовлечены в механизмы реализации эффектов ЭМИ КВЧ длиной волны 7,1 мм: суммация эффектов ЭМИ КВЧ и АЕА, на наш взгляд, свидетельствует об обратном. Не стоит также забывать, что эффекты ЭМИ КВЧ могут быть обусловлены действием эндоканнабиноидов на неспецифические рецепторы (TRPV1, PPAR-α и др.). Кроме того, большинство современных авторов полагают, что мишенями ЭМИ КВЧ в организме человека и животных могут одновременно и в разной степени служить многие биологически активные вещества, в том числе эндоканнабиноиды [15, 16].
Многие авторы связывают антиноцицептивный эффект ЭМИ КВЧ с его противовоспалительным эффектом, что объясняется тесной связью между болевым синдромом и процессами воспаления, а также системным действием данного физического фактора [8, 10]. На этом основании целью следующего этапа исследования являлось изучение влияния ЭМИ КВЧ на уровень ИЛ-6 в сыворотке крови крыс. Как было отмечено выше, данный цитокин играет важную роль в регуляции острой фазы воспаления. Кроме того, ИЛ-6 влияет на проявление болевых ощущений воспалительного генеза, что связано с его модулирующим действием на циклооксигеназу [17]. Изучение роли ИЛ-6 в формировании противовоспалительного и антиноцицептивного эффекта ЭМИ КВЧ позволит, по нашему мнению, раскрыть некоторые механизмы действия этого физического фактора.
Для анализа изменений содержания в крови ИЛ-6 при действии ЭМИ КВЧ в норме и после системной инъекции ЛПС необходимо было определить значение показателя у интактных крыс. Средний уровень ИЛ-6 в сыворотке крови крыс контрольной группы составил 22,7±0,82 пкг/мл. Среднее значение его для группы крыс, получивших за час до забоя внутрибрюшинно ЛПС в дозе 100 мкг/кг, составило 31,1±1,7 пкг/мл, что на 37% выше контрольного значения (рис. 4).
При облучении здоровых крыс ЭМИ КВЧ концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови крыс составила 38,08±3,43 пкг/мл, что на 67,8% больше контрольного значения (см. рис. 4). Стоит отметить, что само по себе повышение концентрации ИЛ-6 в крови далеко не всегда является показателем патологических процессов [18, 19].
В группе крыс, подвергшихся облучению ЭМИ КВЧ длиной волны 7,1 мм через час после инъекции ЛПС, наблюдалось еще более существенное увеличение исследуемого показателя (см. рис. 4).
В данном случае концентрация ИЛ-6 оказалась в 3,05 раза больше аналогичного показателя в контрольной группе и в 2,22 раза больше показателя в группе животных, подвергшихся имитации облучения через час после инъекции ЛПС.
Полученные данные затруднительно интерпретировать с точки зрения классических представлений о роли ИЛ-6 в развитии острого лихорадочного ответа. Действительно, ИЛ-6 является одним из основных провоспалительных цитокинов. Повышение его уровня в крови при развитии системного воспаления приводит к повышению температуры, синтезу простагландинов и иммуноглобулинов [20, 21].
Однако в последние годы были получены данные, свидетельствующие о том, что ИЛ-6 может выполнять и функции противовоспалительного цитокина [22]. При развитии острой фазы воспаления концентрация ИЛ-6 в крови невелика и его синтез регулируется ФНО-α и ИЛ-1β. Однако с увеличением концентрации ИЛ-6 он начинает ингибировать секрецию этих цитокинов по принципу отрицательной обратной связи, активировать продукцию печенью белков острой фазы воспаления и стимулировать гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, что способствует регуляции воспалительного процесса и предотвращает развитие хронического воспаления [19, 20].
Проведенные исследования показывают, что ЭМИ длиной волны 7,1 мм оказывает полимодальный ингибирующий эффект на кожную чувствительность. Однако несмотря на это, наиболее интересным и перспективным для дальнейших исследований, безусловно, является антиноцицептивное действие ЭМИ КВЧ.
Результаты электрофизиологических экспериментов показывают, что влияние ЭМИ КВЧ на афферентную импульсацию в подкожном нерве бедра развивается не сразу, а проявляется через 15—25 мин после облучения. Это позволяет думать, что выявленные изменения, скорее всего, обусловлены действием биологически активных веществ, которые синтезировались, выделялись или активировались под действием КВЧ-облучения.
Согласно полученным данным, в качестве таких веществ могут выступать элементы эндоканнабиноидной системы (эндогенные каннабиноиды и их рецепторы). Это подтверждается сходством и суммацией эффектов ЭМИ КВЧ и одного из основных эндоканнабиноидов — анандамида. Однако эксперименты с антагонистом каннабиноидных рецепторов АМ 281 не дают оснований утверждать, что эндоканнабиноидная система является основной и единственной в реализации локальных эффектов ЭМИ КВЧ.
Важным звеном в реализации эффектов ЭМИ КВЧ, безусловно, является система цитокинов. Согласно проведенным исследованиям, ЭМИ КВЧ увеличивает содержание в крови ИЛ-6 как в норме, так и при системном воспалении. Уровень ИЛ-6 в крови под действием миллиметровых волн на фоне воспаления увеличивается больше, чем в норме, что согласуется с утверждением о более выраженном действии ЭМИ КВЧ в условиях патологии. Полученные сведения будут полезны при дальнейшем изучении действия ЭМИ КВЧ на организм человека и животных в условиях болевого синдрома воспалительного генеза, а также для уточнения современных представлений о механизмах физиологического и лечебного действия этого физического фактора.