Введение
Во всем мире отмечается постоянный рост смертности от злокачественных новообразований, что в значительной степени обусловлено поздней диагностикой и вследствие этого несвоевременным и недостаточно эффективным лечением.
В 2018 г. в России впервые выявлено 5667 случаев злокачественных новообразований глотки, из которых 82,7% — III—IV стадии заболевания, и 6896 случаев злокачественных новообразований гортани, из которых 58,5% — III—IV стадии заболевания [1, 2].
Одна из причин позднего выявления заболевания — отсутствие условий для проведения детального осмотра уха, горла и носа на уровне амбулаторного звена, так как рутинным методом остается осмотр с помощью зеркал (передняя и задняя риноскопия, зеркальная ларингоскопия), однако провести исследование качественно не всегда представляется возможным из-за анатомических особенностей гортани и глотки, повышенного глоточного рефлекса, а также эмоциональной лабильности пациента.
В последние десятилетия широкое распространение получили эндоскопические методы осмотра, так как при их применении возможно получить более детальный обзор гортани и гортаноглотки, в том числе с улучшением визуализации путем 60-кратного и 150-кратного увеличения.
Непрямая эндоскопия позволяет оценить состояние слизистой оболочки и структур гортани в целом, однако осмотр гортани и гортаноглотки может быть затруднен в связи с некоторыми анатомическими особенностями, такими как короткая шея, крупный язык, гипертрофированные небные миндалины, резко выраженный глоточный рефлекс, ригидный надгортанник.
Метод фиброларингоскопии имеет большое преимущество по сравнению с непрямой ларингоскопией: это легкость и безопасность введения инструмента в гортань, большая разрешительная способность оптики, исключающая наличие «слепых» зон.
Однако даже улучшенная визуализация при проведении стандартной эндоскопии не позволяет отличить хроническое воспаление от дисплазии, а дисплазию от злокачественного новообразования. Одним из эндоскопических признаков злокачественных новообразований является несовершенный ангиогенез, для оценки которого применяют усовершенствованные методы эндоскопической визуализации — контактную эндоскопию, NBI-эндоскопию, эндоскопию со световыми фильтрами системы SPIES, а также диагностику с применением флюоресцентных технологий. Эти методы позволяют оценить состояние сосудистого рисунка и архитектонику слизистой оболочки гортани и гортаноглотки, определить индекс пролиферативной активности эпителия.
Каждый из методов имеет ряд преимуществ и недостатков.
Метод контактной эндоскопии позволяет визуализировать сосудистую структуру и клеточную архитектонику поверхностных слоев слизистой оболочки, в связи с высокой митотической активностью неопластические клетки окрашиваются более интенсивно. Преимуществами контактной эндоскопии являются неинвазивность, быстрота и возможность проведения in vivo, недостатком — выполнение исключительно в условиях наркоза.
NBI-эндоскопия (narrow band imaging — изображение в узком спектре света) позволяет расширить диагностические возможности стандартной эндоскопии путем селективного улучшения контрастности кровеносных сосудов, этот эффект достигается путем изменения стандартного светового спектра за счет фильтра, встроенного в источник света, который поглощает все длины волн, кроме двух — 415 и 540 нм. Световые волны определенного спектра абсорбируются исключительно гемоглобином. Таким образом, сеть капилляров на поверхности слизистой оболочки окрашена в коричневый цвет, а венозная сеть подслизистого слоя окрашена в голубой цвет, что дает возможность четко визуализировать их на фоне однородно окрашенной слизистой оболочки. По данным ряда авторов, в том числе M. Kraft и соавт., NBI имеет значительно более высокую, чем эндоскопия, чувствительность (89% и 69% соответственно) и точность (91% и 81% соответственно), специфичность же этих методов сопоставима (93% и 90% соответственно). Преимуществами NBI-эндоскопии являются неинвазивность, возможность применения данного метода на всех этапах обследования пациента, включая догоспитальный [3—5].
Большое диагностическое значение имеет изучение сосудистого рисунка слизистой оболочки гортани с применением световых фильтров системы Storz Professional Image Enhancement System (Karl Storz, Германия). Режим CLARA гарантирует равномерное освещение всех участков эндоскопического изображения за счет увеличения яркости темных областей, что способствует оптимальной визуализации темных областей и глубоко расположенных структур. Режимы SPECTRA A и SPECTRA B улучшают видимость определенных участков цветового спектра за счет повышения контрастности, сдвига и замены цветового спектра.
Одним из чувствительных и информативных методов является метод флюоресцентной диагностики при проведении стандартной эндоскопии гортани.
Спектральный диапазон аппарата покрывает область молекулярных колебаний органических веществ, что позволяет в течение нескольких секунд производить измерение флюоресцентного спектра исследуемого объекта, определять спектральное положение и относительные интенсивности флюоресцентных спектральных линий, визуализировать изменение слизистой оболочки гортани в ранние сроки.
В целом методики эндоскопического осмотра, стандартные и усовершенствованные, помогают визуализировать уже сформировавшуюся опухоль, но перспективным и новым направлением является диагностика злокачественных новообразований на доклинической стадии, а также предраковых состояний. На данный момент применяют молекулярные методы диагностики, актуальными для опухолей головы и шеи являются определение уровня SCCA и определение уровня микроРНК.
SCCA (squamous cell carcinoma antigen) — это опухоль-ассоциированный антиген плоскоклеточной карциномы. Концентрация SCCA отражает степень гистологической дифференцировки опухоли, будучи важным независимым прогностическим маркером. Этот антиген является патогномоничным для плоскоклеточной карциномы гортани и гортаноглотки. По резкому росту уровня SCCA можно судить об агрессивном росте опухоли или метастазировании; увеличение концентрации антигена на фоне лечения свидетельствует либо о неэффективности выбранной схемы лечения, либо о рецидиве опухоли.
МикроРНК — малые некодирующие молекулы РНК (длиной в среднем 21 нуклеотид), обнаруженные у растений, животных и некоторых вирусов, принимающие участие в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов путем РНК-интерференции. Злокачественные опухоли характеризуются неконтролируемым делением клеток, фенотип которых определяется нарушением экспрессии различных генов, поэтому образование микроРНК часто нарушено в клетках различных опухолей, в связи с чем повышается уровень циркулирующих микроРНК [6].
Цель исследования — провести анализ эффективности различных методов эндоскопической и молекулярной диагностики злокачественных новообразований гортани и гортаноглотки.
Задачи: 1) провести сравнительную характеристику существующих методов ранней эндоскопической и молекулярной диагностики опухолей гортани и гортаноглотки; 2) оценить чувствительность и специфичность существующих методов ранней эндоскопической и молекулярной диагностики опухолей гортани и гортаноглотки.
Материал и методы
В отделении онкологии опухолей головы и шеи ФГБУ «НМИЦО ФМБА России» проведено исследование, участие в котором приняли 46 пациентов с подозрением на злокачественные новообразования гортани и гортаноглотки, из них 26 пациентов с новообразованиями гортани, 20 пациентов с новообразованиями гортаноглотки. Среди участников исследования — 41 мужчина и 5 женщин, средний возраст которых составил 57,5 года. Все пациенты обратились в поликлинику ФГБУ «НМИЦО ФМБА России» с жалобами на охриплость. При амбулаторном осмотре проводилась фиброларингоскопия, по данным которой выявлено предположительно злокачественное новообразование гортани или гортаноглотки.
Для дообследования и верификации диагноза пациенты госпитализированы в отделение онкологии опухолей головы и шеи ФГБУ «НМИЦО ФМБА России». В стационаре всем пациентам после повторной фиброларингоскопии выполнена прямая ларингоскопия в условиях эндотрахеального наркоза с одномоментным проведением NBI-эндоскопии, осмотра с применением системы SPIES, контактной эндоскопии, исследования с применением флюоресцентных технологий, после чего проведены биопсия и забор тканей для проведения анализа на концентрацию микроРНК, а также забор крови для определения концентрации SCCA.
NBI-эндоскопию (узкоспектральную эндоскопию) выполняли с помощью ригидного 0° эндоскопа (Karl Storz, Германия), в процессе исследования проводили видеофиксацию для дальнейшего ретроспективного анализа.
Эндоскопическое исследование слизистой оболочки гортани с применением световых фильтров системы Storz Professional Image Enhancement System (SPIES) компании Karl Storz (Германия) проводилось в режимах CLARA, SPECTRA A и SPECTRA B.
Для проведения контактной эндоскопии использовался 0°ригидный эндоскоп с возможностью 60-кратного увеличения. Рабочая поверхность эндоскопа приводилась в контакт с поверхностью слизистой оболочки для оценки сосудистого рисунка исследуемой области. Далее слизистую оболочку обрабатывали раствором метиленового синего, после чего становилось доступным к осмотру клеточное строение.
При проведении исследования с применением флюоресцентных технологий применяли аппаратно-программный комплекс «ИнСпектр-М». Диагностика проводилась путем локального контактного подведения лазерного луча с длиной волны 350 нм к неизмененным и патологически измененным участкам слизистой оболочки гортани или гортаноглотки, после чего на обследуемых участках выполняли оценку индекса пролиферативной активности эпителия. В точке наибольшего индекса пролиферативной активности осуществляли прицельную биопсию для выполнения гистологического исследования и забор материала для проведения анализа на концентрацию микроРНК (см. рис. 1 на цв. вклейке, рис. 2).
Рис. 1. Установка диагностического зонда через дополнительный канал фиброскопа на измененную слизистую оболочку левой голосовой складки.
Рис. 2. Фиксация данных, полученных при исследовании с применением флюоресцентных технологий и аппарата «ИнСпектр-М».
а — график, полученный при проведении диагностики в интактной точке; б — график, полученный при проведении диагностики в центре новообразования (Wavelength, nm — длина волны (нм), Intensity — интенсивность излучения, индекс пролиферативной активности эпителия определяется в диапазоне длины волны от 625 до 650 нм).
Для определения уровня SCCA проводили забор 3—5 мл венозной крови и ее иммунохемилюминесцентный анализ. В норме концентрация SCC-антигена не превышает 2 нг/мл.
Производили забор опухолевой ткани и нормального участка слизистой оболочки на расстоянии 10 мм от опухоли. Образцы тканей помещали в пробирки со специальным консервирующим раствором RNAlater и хранили при температуре –80°C. Тотальную фракцию РНК выделяли набором реагентов NucleoBond RNA/DNA согласно стандартным протоколам. Анализ экспрессии конкретных микроРНК производили по технологии TaqMan MicroRNA Assays. Уровень экспрессии микроРНК в ткани рассчитан согласно методу Pfaffl, в качестве гена-рефери выбраны микроРНК-103 и мРНК U6. Выделены 3 типа микроРНК: miR-181a, miR-124, miR-107.
1) miR-181a. Регулирует пролиферацию, миграцию, инвазию и колониеобразующую способность раковых клеток головы и шеи. miR-181a участвует в регуляции 10 сигнальных путей, а именно р53/ДНК, TGF-beta, МАРК/ERK, МАРК/JNK, Hypoxia, Myc/Max, Cellcycle/pRB-E2F, Notch, Wnt и NFκB. По сравнению с уровнем в нормальных тканях miR-181а может экспрессироваться на высоком уровне при раке головы и шеи.
2) miR-124. Эктопическая экспрессия miR-124 в клетки ингибирует клеточную пролиферацию, колониеобразование, миграцию и инвазию in vitro, а также опухолевый рост и метастазы in vivo. Обнаружено, что экспрессия miR-124 статистически значимо выше на I стадии заболевания, в то время как пациенты со II стадией заболевания имели более низкий уровень экспрессии miR-124.
3) miR-107. Эктопическая экспрессия miR-107 в клетки SCC15, SCC25 и CAL27 (клетки плоскоклеточной карциномы головы и шеи) позволяет снизить туморогенный потенциал этих клеток in vitro и in vivo. Обработка клеток miR-107 существенно блокирует клеточную пролиферацию, репликацию ДНК, колониеобразование и инвазию раковых клеток. Содержание miR-107 при раке головы и шеи снижено; это показывает, что miR-107 функционирует как опухолевый супрессор [6].
Статистическая обработка данных произведена с использованием программы Statistica 8.0.
Результаты
При гистологическом исследовании у 31 (67,4%) из 46 пациентов выявлен плоскоклеточный рак, в том числе TisN0 — у 17 (54,8%), Т1N0 — у 9 (29%) и Т2N0 — у 5 (16%), у 8 (17,4%) пациентов обнаружены предраковые состояния (дисплазия 1—3 степени), у 2 (4,3%) — плоскоклеточные папилломы, у 4 (8,7%) — хронический ларингит, у 1 (2,17%) — полип с изъязвлением. При обследовании 31 пациента с верифицированным плоскоклеточным раком у 12 выявлена низкодифференцированная карцинома, у 12 — умеренно дифференцированная карцинома и у 7 — высокодифференцированная карцинома (табл. 1).
Таблица 1. Гистологические характеристики биопсийного материала, полученного у пациентов с подозрением на опухоль
| Вид опухоли | Пациенты, n |
| Плоскоклеточный рак | |
| Низкодифференцированный плоскоклеточный рак | 12 |
| Умеренно дифференцированный плоскоклеточный рак | 7 |
| Высокодифференцированный плоскоклеточный рак | 7 |
| Дисплазия | 8 |
| Плоскоклеточная папиллома | 2 |
| Хронический ларингит | 4 |
| Отечный полип | 1 |
По данным эндоскопических методов обследования при NBI-эндоскопии истинно положительные патологические изменения отмечались у 26 (83,8%) из 31, истинно отрицательные результаты — у 13 (86,6%) из 15 пациентов. При эндоскопическом исследовании слизистой оболочки гортани и гортаноглотки с применением световых фильтров системы Storz Professional Image Enhancement System истинно положительные патологические изменения отмечались у 27 (87%) из 31, истинно отрицательные результаты получены у 11 (73,3%) из 15 пациентов. При контактной эндоскопии истинно положительные патологические изменения отмечались у 25 (80,1%) из 31, истинно отрицательные результаты получены у 9 (60%) из 15 пациентов. При проведении эндоскопического исследования с применением флюоресцентных технологий истинно положительные патологические изменения отмечались у 28 (90,3%) из 31, истинно отрицательные результаты получены у 14 (93,3%) из 15 пациентов. По данным молекулярных методов исследования повышение уровня SCCA было истинно положительным у 17 (54,8%) из 31, истинно отрицательные результаты наблюдались у 12 (80%) из 15 пациентов (табл. 2).
Таблица 2. Результаты различных методов диагностики, использованных в данном исследовании
| Метод | Истинно положительный результат, n | Ложноположительный результат, n | Ложноотрицательный результат, n | Истинно отрицательный результат, n |
| Стандартная эндоскопия | 31 | 15 | — | — |
| NBI-эндоскопия | 26 | 6 | 1 | 13 |
| Эндоскопия с применением системы SPIES | 27 | 6 | 2 | 11 |
| Контактная эндоскопия | 25 | 8 | 4 | 9 |
| Эндоскопия с применением флюоресцентных технологий | 28 | 3 | 1 | 14 |
| SCCA | 17 | 1 | 16 | 12 |
Методика стандартной эндоскопии, выполняемая всем пациентам на амбулаторном этапе, стала отборочным фактором для госпитализации пациентов, поэтому этот метод мы рассматривали только как истинно положительный и ложноположительный.
В связи с тем, что большинство эндоскопических методов направлены на оценку состояния сосудистого рисунка, а низкодифференцированная плоскоклеточная карцинома обладает более несовершенным ангиогенезом, чем высокодифференцированная, частота ее выявления при проведении эндоскопических методов осмотра незначительно выше, чем высокодифференцированной плоскоклеточной карциномы (табл. 3).
Таблица 3. Частота выявления плоскоклеточной карциномы гортани и глотки различными эндоскопическими методами диагностики
| Метод | Плоскоклеточный рак | ||
| низкодифференцированный плоскоклеточный рак, n | умеренно дифференцированный плоскоклеточный рак, n | высокодифференцированный плоскоклеточный рак, n | |
| Стандартная эндоскопия | 11 | 10 | 6 |
| NBI-эндоскопия | 11 | 10 | 5 |
| Эндоскопия с применением системы SPIES | 11 | 9 | 5 |
| Контактная эндоскопия | 11 | 9 | 5 |
| Эндоскопия с применением флюоресцентных технологий | 12 | 11 | 5 |
Чувствительность и специфичность эндоскопических и молекулярных методов диагностики представлены в табл. 4.
Таблица 4. Чувствительность и специфичность эндоскопических и молекулярных методов диагностики
| Метод | Чувствительность, % | Специфичность, % |
| NBI-эндоскопия | 83,8 | 86,6 |
| Эндоскопия с применением системы SPIES | 87 | 73,3 |
| Контактная эндоскопия | 80,1 | 60 |
| Эндоскопия с применением флюоресцентных технологий | 90,3 | 93,3 |
| SCCA | 54,8 | 80 |
У 9 (28%) обследованных больных наблюдалось увеличение содержания зрелой miR-181 по сравнению с ее содержанием в окружающей ткани, а у 5 (16%) больных — снижение этого показателя.
Отмечено статистически значимое увеличение содержания miR-124 в опухолях гортани по сравнению с близлежащей нормальной тканью, содержание miR-124 сильно варьировало не только в опухолях, но и в окружающей опухоль ткани. Вероятно, miR-124 может быть супрессором или онкогеном в зависимости от клеточного контекста.
В наших исследованиях у 12 (38%) больных в опухолях уровень miR-107 существенно снижался, а у 8 (25%) пациентов был повышен.
По данным, полученным при изучении концентрации микроРНК, мы выявили определенные изменения, однако говорить о статистически значимой корреляции на данный момент невозможно ввиду малой выборки пациентов. Требуется проведение дополнительного исследования для оценки диагностической значимости метода в ранней диагностике.
Выводы
Несмотря на то что биопсия с последующим гистологическим исследованием остается «золотым стандартом» диагностики, эндоскопические и молекулярные методы диагностики зарекомендовали себя как эффективные дополнительные методы выявления патологии гортани и гортаноглотки.
До настоящего времени поиск универсальных методов диагностики рака головы и шеи является актуальной задачей. Применение эндоскопических методов исследования, в том числе в различных режимах, не позволяет со 100%-й достоверностью говорить о наличии у пациента рака. По-прежнему прижизненная микроскопия и исследование в различных спектрах позволяют лишь определить участки с максимально выраженными изменениям для проведения прицельной биопсии. Применение онкологических маркеров, как известных ранее, так и новых, дополняет данные визуальных методов исследования.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.