Полипозный риносинусит (ПРС) является хроническим заболеванием слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух. Он характеризуется рецидивирующим ростом полипов, разрастанием железистого эпителия с пролиферацией провоспалительных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки и стромальным фиброзом [1].
Гиперплазия слизистой оболочки с образованием полипов рассматривается как результат нарушения баланса пролиферативных и апоптотических процессов и дисрегуляции соответствующих молекулярно-клеточных механизмов [2]. Инициировать пролиферативную активность и воспаление в слизистой оболочке полости носа могут активная дегрануляция тучных клеток, провоспалительные цитокины, синтезируемые клетками стромы, а также воспалительные медиаторы нейрокининовой системы (SP, CGRP) [3]. В то же время проапоптотические факторы, индуцирующие апоптоз, способствуют удалению поврежденных клеток, подавляют секрецию воспалительных цитокинов, уменьшают проницаемость микроциркуляторного русла и миграцию лейкоцитов в ткани, тем самым предотвращают дальнейшее разрастание эпителия и стромы [4, 5]. Однако данные о молекулярной регуляции апоптоза в полипозно измененной слизистой оболочке носа человека отсутствуют.
Цель работы — изучить экспрессию проапоптотических (p53, p21) и антиапоптотических (MDM2) факторов, а также распределение пролиферирующих PCNA-иммунореактивных клеток в слизистой оболочке полости носа при различных типах ПРС.
Материал и методы
Исследованы полипы, полученные во время хирургической операции (полипотомия) у пациентов женского и мужского пола в возрасте от 40—70 лет (средний возраст 53,7±2,6 года) с клиническим диагнозом ПРС.
Критерии включения: группа исследования представлена пациентами с клинически верифицированным диагнозом ПРС, с жалобами на отсутствие или затруднение носового дыхания на протяжении более 6 мес, данными эндоскопического исследования полости носа, без предшествующего хирургического лечения (полипотомия); отсутствие сопутствующей воспалительной (гнойный верхнечелюстной риносинусит) и аллергической (аллергический ринит, бронхиальная астма, аспириновая триада) патологии слизистой оболочки носа (n=50).
Критерии исключения: антрохоанальные полипы, инвертированная папиллома, злокачественные заболевания полости носа и околоносовых пазух, фиброзно-кистозная дегенерация слизистой оболочки околоносовых пазух.
Группа контроля: пациенты с клинически верифицированным диагнозом «искривление перегородки носа», которым была проведена риносептопластика. Основной жалобой данной группы пациентов было затрудненное носовое дыхание (n=20). Диагноз подтвержден данными осмотра (передняя риноскопия и эндоскопическое исследование полости носа) (табл. 1).
Включение пациентов в исследуемую и контрольную группы осуществлялось при наличии документального согласия пациента, все пациенты направлены в оториноларингологическое отделение Владивостокской клинической больницы № 1. Всем пациентам проведено полное клиническое предоперационное обследование, включающее эндоскопический осмотр полости носа, рентгенографию околоносовых пазух, для оценки тяжести и распространенности заболевания.
Исследование одобрено междисциплинарным комитетом по этике Тихоокеанского государственного медицинского университета.
Для иммуногистохимического исследования материал фиксировали в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере в течение 24 ч, после чего промывали 0,1 M Na-фосфатным буфером (pH 7,2) с 6—7-кратной сменой раствора и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 10 мкм монтировали на предметные стекла, депарафинировали и инкубировали с кроличьими поликлональными первичными антителами против p53, р21, MDM2, PCNA (Abcam, США), разведенными в отношении 1:200 в фосфатном буфере, содержащем Тритон Х-100 и нормальную козью сыворотку, в течение ночи при комнатной температуре. После промывки срезы в течение 1 ч инкубировали в растворе биотинилированных вторичных антител против IgG кролика при разведении 1:100 (Vector Laboratories, США), а затем в растворе авидин-пероксидазного комплекса (Vectastain ABC Kit, Vektor Laboratories, США). Затем срезы промывали фосфатным буфером в течение 10 мин, обезвоживали и заключали в бальзам по обычным правилам. В качестве контроля из среды исключали первичные антитела, окрашивание клеток отсутствовало. Часть срезов докрашивали гематоксилином.
Препараты просматривали в световом микроскопе AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали с помощью цифровой камеры AxioCam ICc3 (Carl Zeiss, Германия). Относительную плотность клеток вычисляли в единице объема (из расчета на 0,01 мм2) ткани с учетом поправки на толщину среза и диаметр ядра. Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ Statistica для Microsoft Windows, версия 6.0. Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего М±m. Для оценки значимости полученных результатов применяли t-критерий Стьюдента, значение доверительного интервала р<0,05 считали статистически значимым.
Результаты и обсуждение
По гистологической картине полипы были разделены на отечные, эозинофильные (аллергические) и фиброзно-воспалительные (нейтрофильные).
Слизистая оболочка полости носа у пациентов контрольной группы не имеет видимых патологических изменений. Высота мерцательного эпителия составляет 87,2±6,3 мкм. Структура и положение основных клеточных типов эпителиального пласта сохранены. В рыхлой соединительной ткани собственной пластинки наблюдаются клетки фибробластического ряда, а вокруг микрососудов располагаются немногочисленные лимфоциты, эозинофилы и тучные клетки. При окрашивании срезов на p53, p21, MDM2 и PCNA реагируют однородные популяции клеток во всех слоях слизистой оболочки (табл. 2).
Слизистая оболочка полипов обычно покрыта многорядным мерцательным эпителием, в составе которого преобладают бокаловидные и безреснитчатые клетки, лежащие на утолщенной гиалинизированной базальной мембране. Последняя на некоторых участках теряет свою непрерывность, эпителий здесь может отсутствовать либо становится многослойным плоским. Подлежащая соединительная ткань закономерно меняется и приобретает специфический характер для каждого типа полипа.
Строма полипов отечного, эозинофильного (аллергического) типа имеет ячеистую структуру, небольшое количество фибробластов и разнонаправленные коллагеновые волокна. В подэпителиальном слое встречаются очаги воспалительных инфильтратов из лимфоцитов, плазмоцитов, моноцитов, эозинофилов и тучных клеток. Клетки, как правило, располагаются вокруг сосудов или диффузно в рыхлой соединительной ткани. При окрашивании гематоксилином и эозином их плотность составляет 41,9±3,3 клетки/0,01 мм2. В строме и эпителии полипов наблюдается выраженная экспрессия р53/PCNA и умеренная позитивная реакция р21/MDM2 (см. табл. 2, рис. 1).
В строме полипов фиброзно-воспалительного (нейтрофильного) типа имеются разрастания грубоволокнистой либо тонкопетлистой соединительной ткани с небольшим числом фибробластов и разветвленная васкуляризация. Характерной особенностью этого типа полипов является наличие кистозных образований, заполненных гомогенным секретом. В глубине стромы и под эпителием располагаются очаговые или диффузные полиморфно-клеточные воспалительные инфильтраты (плотность клеток воспалительного инфильтрата в 0,01 мм2 — 53,1±4,1). Распределение р53, р21 и PCNA преобладает в клетках рыхлой соединительной ткани. MDM2-клетки немногочисленны и локализуются только в собственной пластинке слизистой оболочки (см. табл. 2, рис. 2).
В исследованном нами материале ткани полипов обнаруживается единообразный паттерн провоспалительных клеток, который указывает на типичный характер продуктивного воспаления. ПРС здесь инициируется высокой экспрессией ключевых воспалительных факторов (IL-5, CCL11, TNF, TGF-β) и нейропептидов (субстанция P, вазоинтестинальный полипептид, нейропептид Y). Эти факторы также способны индуцировать патологические формы апоптоза [6, 7].
Значение апоптоза в развитии хронических воспалительных заболеваний подтверждено в ряде исследований [8—13]. Хорошо известны морфологические критерии апоптоза и сложные каскады молекулярных реакций, запускающих и стабилизирующих программированную гибель клеток [4, 9, 14, 15]. Так, в формировании патологических форм апоптоза участвуют более 30 факторов, однако его эффекторную стадию запускают каспаза-3 и факторы транскрипции р53 и р21. Баланс этих молекул контролируют пептиды, блокирующие наступление апоптоза, где Bcl-2 и MDM2 принадлежит основная регулирующая роль [9, 16]. Мы обнаружили повышенную экспрессию р53, р21, MDM2 и PCNA в эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки полипов. Наши результаты согласуются с выводами L. Uller и соавт. [4], которые показали наличие молекулы p85 в тканях полипа на ранней стадии апоптоза. Другие авторы [7] установили в полипах сверхэкспрессию Bcl-2.
Нами показано, что интенсивность апоптоза зависит от клинико-морфологического типа полипов. Большое количество р53-иммунореактивных клеток выявляется в полипах отечного, эозинофильного (аллергического) типа. Здесь также отмечается парадоксально высокая экспрессия PCNA. Можно полагать, что хроническое иммунное воспаление приводит к формированию в полипе гетерогенных популяций клеток, одна из которых элиминируется через апоптоз, а другая поддерживает непрерывный генез ПРС. Напротив, в полипах фиброзно-воспалительного (нейтрофильного) типа пролиферация и гибель клеток незначительны, что также находит подтверждение при исследовании каспазы-3 и -9 у пациентов с ПРС [17].
Баланс про- и антиапоптотических факторов формирует молекулярный «реостат», определяющий динамику и исход хронического иммунного воспаления [10]. Морфологическим эквивалентом этого баланса является установленное нами соотношение р53/PCNA в тканях полипов. Распространение программированной гибели клеток при ПРС представляет результат регуляции специфических генов, где эпигенетические воздействия остаются определяющими [18]. Поэтому высокие значения проапоптотических факторов р53, р21, а также Вах и каспазы-3 [16, 17] могут препятствовать малигнизации растущих полипов.
Заключение
ПРС характеризуется продуктивным воспалением, которое сопровождается гиперплазией слизистой оболочки и рецидивирующим ростом полипов. Клинико-морфологические типы полипов подтверждают неодинаковую экспрессию факторов апоптоза. Наименьшая экспрессия р53, р21 и MDM2 отмечается при фиброзно-воспалительном (нейтрофильном) типе, наиболее высокая — при отечном, эозинофильном (аллергическом) типе полипов. Различная экспрессия проапоптотических факторов противостоит воспалительным пролиферативным процессам и является потенциальной мишенью прецизионной фармакотерапии ПРС.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interest.
Сведения об авторах
Матвеева Н.Ю. — е-mail: nymatveeva@mail.ru; https://0000-0003-0844-7950
Павлуш Д.Г. — е-mail: pavlush.dmitrij@yandex.ru; https://0000-0003-4794-9777
Калиниченко С.Г. — е-mail: sgkalinichenko@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-1434-765X
Автор, ответственный за переписку: Матвеева Н.Ю. — е-mail: nymatveeva@mail.ru