Борисова О.Ю.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия населения, Москва, Россия, 125212

Гуров А.В.

Кафедра оториноларингологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, Москва

Гадуа Н.Т.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия населения, Москва, Россия, 125212

Ефимов Б.А.

ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия

Кафарская Л.И.

ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия

Афанасьев С.С.

ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского», Москва, Россия

Борисова А.Б.

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Россия

Микробиоценоз небных миндалин у практически здоровых лиц

Журнал: Вестник оториноларингологии. 2018;83(5): 31-35

Просмотров : 371

Загрузок : 11

Как цитировать

Борисова О. Ю., Гуров А. В., Гадуа Н. Т., Ефимов Б. А., Кафарская Л. И., Афанасьев С. С., Борисова А. Б. Микробиоценоз небных миндалин у практически здоровых лиц. Вестник оториноларингологии. 2018;83(5):31-35.
Borisova O Yu, Gurov A V, Gadua N T, Efimov B A, Kafarskaja L I, Afanas’ev S S, Borisova A B. The microbiocenosis of the palatal tonsils in the practically healthy people. Vestnik Oto-Rino-Laringologii. 2018;83(5):31-35.
https://doi.org/10.17116/otorino20188305131

Авторы:

Борисова О.Ю.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия населения, Москва, Россия, 125212

Все авторы (7)

Микробиом представляет собой экосистему, состоящую из совокупности микроорганизмов, которая динамически меняется и находится в тесной симбиотической взаимосвязи с макроорганизмом. Микробиом выполняет множество различных функций, в том числе формирование колонизационной резистентности, поддержание гомеостаза, участие в иммунных реакциях, водно-солевом обмене, синтезе витаминов, детоксикации ксенобиотиков и т. д. [1]. Учитывая тесную взаимосвязь между микробиоценозом и макроорганизмом, изменения количественного и качественного состава микробиома будут влиять на состояние как отдельных органов и систем, так и в целом на здоровье человека.

Существенный вклад в изучение микрофлоры человека вносит осуществляемый в настоящее время международный проект Human Microbiome Project, инициированный в 2008 г. National Institutes of Health [1]. Задачами этого проекта являются исследование микробиома человека, выявление взаимосвязей между изменением состава сообщества микроорганизмов и здоровьем/патологией человека, а также создание стандартизованного методологического подхода и информационного ресурса для его изучения. В ходе выполнения проекта разработаны унифицированные молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов, составляющих микробиом. Количество вновь открываемых видов микроорганизмов значительно возросло благодаря применению последних достижений метагеномных исследований и особенно высокопроизводительного секвенирования при изучении микробиоценозов [2—4].

Исследования, посвященные изучению микробных сообществ, показали, что микроорганизмы в них обмениваются между собой сигнальными молекулами, стимулирующими или ингибирующими их рост, а также изменяют величину экспрессии их факторов патогенности и персистенции [2, 3, 5, 6].

Ротоглотка представляет собой уникальный микробиоценоз, находящийся на стыке дыхательной и пищеварительной систем, который играет несомненную роль в профилактике инфекций респираторного тракта [4, 7—10]. Микробиом ротоглотки включает в себя многообразие видов микроорганизмов, большинство из которых являются резидентными, приспособленными к колонизации в этом биотопе и взаимодействующими с местными эпителиальными клетками и лимфаденоидной тканью [11].

Нормальная микрофлора ротоглотки активно участвует в поддержании общего гомеостаза и защите нашего организма от обсеменения болезнетворными микроорганизмами. Кроме того, резидентная микрофлора участвует в синтезе витаминов, источников энергии и метаболитов, которые обладают противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. Но при сбоях в иммунной системе, воздействии респираторных вирусных патогенов, а также при наличии источника инфекции в полости рта нарушается баланс между резидентными и транзиторными микроорганизмами, что приводит к появлению различной патологической симптоматики. Помимо этого, микрофлора ротоглотки у здоровых людей также зависит от степени очищения слизистой оболочки от остатков пищи, клеточного детрита, слизи, которые служат питательной средой для многих микроорганизмов [7, 9].

Необходимо отметить, что в норме микробиоценозы представляют собой сложные динамические структуры, в состав которых входят резидентные и транзиторные микроорганизмы [1]. Соотношения микроорганизмов в разных биотопах различаются и при разных состояниях здоровья. Изучение микробиоценозов и их роли в поддержании здоровья и развитии патологии является сложной многофакторной задачей, включающей исследование не только самих микробных сообществ, но и компонентов и метаболитов микрофлоры, взаимодействий с макроорганизмом с учетом персонификации и социальных факторов (проживание в разных регионах, загрязнение воздуха, курение, уход за полостью рта и т. д.) [7, 8]. Кроме того, было установлено, что потеря разнообразия в микробиоме ведет к снижению защитного влияния микробиома, развитию широкого диапазона неблагоприятных влияний и патологии [10]. Исследованиями было показано влияние микробиома на развитие таких заболеваний, как атеросклероз, болезнь Паркинсона, ожирение, сахарный диабет 2-го типа и аутизм. Кроме того, микробиом является резервуаром генов резистентности к антибактериальным препаратам [1].

Таким образом, можно утверждать, что возникновение, степень тяжести, а также интенсивность развития гнойно-воспалительных заболеваний ротоглотки напрямую зависят от качественного и количественного состава микрофлоры, контаминирующей слизистую оболочку ротоглотки, в частности небных миндалин, а также от индивидуальных биологических свойств данных микроорганизмов.

Учитывая тот факт, что микрофлора проксимальных отделов лакун небных миндалин в отличие от остальных отделов слизистой оболочки ротоглотки минимально подвержена воздействию различных экзогенных факторов, она представляет собой относительно стабильный по качественному и количественному составу биоценоз. В то же время хорошая оксигенация данного отдела лакун небных миндалин в отличие от дистальных отделов предполагает те же физиологические условия персистенции микроорганизмов, что и на слизистой оболочке задней и боковых стенок глотки, небных дужках и т. д.

Цель исследования — изучение количественного и качественного состава культивируемых микроорганизмов, выделенных из проксимальных отделов лакун небных миндалин у практически здоровых лиц.

Пациенты и методы

В исследовании принимало участие 48 практически здоровых лиц — добровольцев в возрасте от 18 до 30 лет в период с октября 2016 г. по апрель 2017 г., из них 28 (58,3%) женщин и 20 (41,7%) мужчин. К практически здоровым относили обследуемых, в анамнезе которых не было хронических заболеваний ЛОР-органов, отсутствовали жалобы и объективные признаки патологических изменений ротоглотки на момент обследования.

Взятие материала из проксимальных отделов лакун небных миндалин осуществляли утром натощак с помощью стерильных одноразовых сухих коммерческих тампонов («Copan», Италия), его доставляли в лабораторию в термоконтейнерах в течение 2 ч, соблюдая температурный режим.

Для стандартизации количественной оценки роста микроорганизмов клинический материал засевали по Голду тампоном на 0,5 чашки с 20% агаром с кровью крупного рогатого скота («Лейтран», Москва), в качестве агаровой основы использовали сухой питательный ГРМ-агар (ГНЦПМБ, Оболенск). Посев осуществляли плотными непрерывными штрихами (сектор А) и рассевом калибровочной петлей 10 мкл на секторы I, II и III. Параллельно клинический материал с тампонов засевали на следующие питательные среды: уриселект («Bio-Rad», США), желточно-солевой агар (на основе солевого агара) и агар Сабуро («HiMedia», Индия). Все посевы культивировали по стандартной методике при температуре 37 °C в течение 24—48 ч.

Идентификацию микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Тинкториальные свойства изучали методом окраски по Граму по общепринятой методике в соответствии с инструкцией производителя. Биохимическую идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли с помощью коммерческих биохимических тест-систем PLIVA-Lachema Diagnostica (Чехия).

Для видовой идентификации микроорганизмов использовали масс-cпектрометрический метод с помощью времяпролетного масс-спектрометра BioMerieux VITEK MS MALDI-TOF («bioMerieux», Франция) и секвенирование гена 16SrRNA.

Хромосомальную ДНК выделяли методом кипячения из чистых культур бактерий, выращенных на кровяном агаре по методу Т. Маниатис (1984). Далее одну микробиологическую петлю культуры суспендировали в 150 мкл деионизированной воды и инкубировали 20 мин при 95 °C, после чего центрифугировали при 12 000 об/мин. Выявление фрагментов гена 16SrRNA осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции по стандартному протоколу [2, 3]. Реакционная смесь содержала 1,5 ммоль MgCl2, 10 ммоль Tris-HCl (pH 8,3), 50 ммоль KCl, 1,0 мкмоль каждого праймера, по 200 мкмоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата («Fermentas», Литва) и 1UTaq-DNA полимеразы («Fermentas», Литва) в окончательном объеме 25 мкл. Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей проводили в термоциклере Терцик («ДНК-технология», Москва) и С-1000 Touch («Bio-Rad», США). Детекцию результатов амплификации осуществляли путем постановки горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле при 160 V в течение 40 мин с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Секвенирование фрагментов ДНК штаммов коринебактерий осуществляли согласно общепринятому методу Сэнгера (Sanger F.) в компании ЗАО «Евроген» (Москва). Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программного обеспечения BLAST и ChromasLite (для формата хроматограммы), секвенированные последовательности сопоставляли с международной онлайн-базой данных EMBL/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore).

Результаты и обсуждение

С целью установления количественного состава микрофлоры, колонизирующей биотоп проксимальных отделов лакун небных миндалин, обследованы 48 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 30 лет. Полуколичественную оценку микробного роста провели на основе эмпирических исследований в зависимости от количества выросших колоний при прямом посеве биоматериала, в пересчете в КОЕ/мл/г (см. таблицу).

Шкала оценки степени микробной обсемененности

Количественная оценка микробного роста показала, что у практически здоровых лиц степень обсемененности лакун небных миндалин микроорганизмами варьировала от 3 до 6 Lg КОЕ/мл. Количество выросших колоний при прямом посеве составило в концентрации 3 Lg КОЕ/мл — 8,3%, 4 Lg КОЕ/мл — 25%, 5 Lg КОЕ/мл — 25%, 6Lg КОЕ/мл — 41,7%. Следовательно, у большинства обследованных лиц в микробиоте миндалин выявлена средняя степень микробной обсемененности в пределах 4—6 Lg КОЕ/мл.

В результате проведенного анализа микробного пейзажа культивируемых микроорганизмов, выделенных из проксимальных отделов лакун небных миндалин практически здоровых лиц, идентифицировано 153 различных штамма, принадлежащих к 6 родам микроорганизмов. Из них большинство штаммов — 54 (35,4%) — принадлежало к роду Streptococcus; 36 (23,5%) штаммов — к роду Rothia; 21 (13,7%) штаммов — к роду Actinomyces; 18 (11,7%%) — к роду Staphylococcus, 15 (9,8%) штаммов — к роду Corynebacterium и 9 (5,9%) штаммов — к роду Micrococcus.

В исследуемом микробиоме наиболее многочисленной и разнообразной по видовому составу была группа микроорганизмов рода Streptococcus. При этом было идентифицировано 54 штамма, относящихся к 5 видам микроорганизмов этого рода. Наибольший удельный вес в структуре микробного пейзажа имели α- и γ-гемолитические стрептококки: Streptococcus parasanguinis — 27 (50%) штаммов, Streptococcus mitis — 12 (22,1%) штаммов, Streptococcus salivarius — 9 (16,7%) штаммов, Streptococcus oligofermentans — 3 (5,6%) штамма, а также не определенные до видовой принадлежности Streptococcus spр. — 3 (5,6%).

Второй по распространенности группой микроорганизмов явились бактерии рода Rothia являющиеся родом грамположительных, неподвижных, не образующих спор бактерий. В ходе исследования нами было идентифицировано 36 штаммов, относящихся к 2 видам микроорганизмов этого рода. Из них 30 (83,3%) штаммов относились к виду Rothia mucilaginosa и 6 (16,7%) штаммов — к виду Rothia dentocariosa.

Среди микроорганизмов, относящихся к родам Actinomyces и Staphylococcus, выделены штаммы только одного вида — 21 штамм Actinomyces spр. оral и 18 штаммов Staphylococcus аureus. Также в биотопе миндалин идентифицировано 15 штаммов, относящихся к роду Corynebacterium. Среди них по 6 (40%) штаммов принадлежало к видам Corynebacterium accolens и Corynebacterium tuberculostearicum, 3 (20%) штамма принадлежало к Corynebacterium spр. Помимо этого, 9 штаммов были идентифицированы как Micrococcus luteus.

Количественный состав микроорганизмов, выделенных с миндалин мужчин и женщин, был практически одинаковым — 78 (51%) и 75 (49%) штаммов соответственно. Однако на этом фоне удалось обнаружить определенные различия в качественном составе микроорганизмов. Так, у мужчин обнаружено 10 видов микроорганизмов, в то время как у женщин — 8 видов. Видовой состав выделенных бактерий представлен на рисунке.

Видовой состав выделенных микроорганизмов у обследованных мужчин и женщин.

При этом у всех обследованных лиц обнаружены ассоциации микроорганизмов, из которых идентифицированы ассоциации из 4 (50%), 5 (41,6%) и 3 (38,4%) микроорганизмов. Наиболее распространенными в качественном составе ассоциаций явились штаммы R. mucilaginosa и Actinomyces spр. оral (83,3 и 58,3% случаев соответственно). Следующим по распространенности в ассоциациях были штаммы S. parasanguinis и S. salivarius — по 33,3% случаев.

Проведенные с помощью технологий секвенирования геномов бактерий в последние годы исследования показали, что в ротоглотке имеются пять филотипов микроорганизмов — Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria и Fusobacteria [5, 9, 10]. Однако в большинстве представленных работ проведенный метагеномный анализ дает представление только о родах микроорганизмов без идентификации видового состава, в то время как проведенное нами исследование с помощью масс-спектрометрии и секвенирования геномов показало, что микробиом проксимальных отделов лакун небных миндалин (который в качественном составе соответствует рецидентной микрофлоре ротоглотки) у практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 30 лет представляет собой гетерогенную бактериальную популяцию (консорциум) с определенной плотностью, состоящую из 4—5 бактериальных ассоциаций с преимущественным преобладанием грамположительных микроорганизмов. Все выделенные нами микроорганизмы относились к двум филотипам — Proteobacteria и Actinobacteria. Среди этих филотипов у обследуемых практически здоровых лиц молодого возраста доминировали микроорганизмы рода Streptococcus, на втором месте по частоте встречаемости — микроорганизмы рода Rothia, на третьем месте — микроорганизмы родов Actinomyces и Staphylococcus и в единичных количествах — представители родов Corynebacterium и Micrococcus.

Проведенные нами исследования позволили охарактеризовать микробиоценоз миндалин у практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 30 лет. С помощью масс-спектрометрического метода секвенирования идентифицировано 153 штамма, относящихся к 6 родам 2 филотипов, которые встречаются в виде ассоциаций из 4—5 микроорганизмов с доминированием микроорганизмов рода Streptococcus. Полученные данные расширяют знания о микробиоме ротоглотки и создают предпосылки для уточнения вклада микробиотических сообществ в развитие заболеваний верхних дыхательных путей. Изучение состава микробных ассоциаций необходимо для понимания взаимосвязи между изменчивостью микробиома — здоровьем — болезнью, а также для определения понятий «основной человеческий микробиом» и «молекулярные маркеры диагностики дисбиозов».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

1, 2e-mail: olgborisova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6316-5046

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail