Актуальной проблемой современной офтальмологии является изучение этиопатогенетических механизмов различных патологических состояний органа зрения. Решение этой задачи является многоэтапным процессом, в котором наряду с анализом клинических данных необходимо проведение экспериментальных исследований. При этом в качестве экспериментальных моделей могут быть использованы как лабораторные животные (исследования in vivo), так и клеточные модели (исследования in vitro).

В настоящем сообщении обобщены результаты экспериментальных исследований, проведенных на культурах клеток эпителия, стромы роговицы и лимба, а также слизистой носослезного протока.

Эпителий и лимб

Как известно, инстилляционный путь введения лекарственных средств является основным в лечении офтальмологических заболеваний. В связи с этим глазная поверхность представляет собою потенциальную мишень цитотоксического влияния лекарств, которое может проявляться эпителиопатией, обусловленной прямым деструктивным действием на эпителиоциты, или опосредованно угнетением депо стволовых клеток, расположенного в области лимба. Адекватной моделью для оценки степени цитотоксичности лекарственных средств могут быть первичные культуры клеток глазной поверхности человека, в частности эпителия роговицы и конъюнктивы, а также популяции стволовых клеток лимба.

Методом проращивания из экспланта были получены эпителиоциты роговицы, имеющие характерную морфологию «булыжной мостовой» (рис. 1, а) и экспрессирующие как стволовой маркер — белок CK19 (рис. 1, б), так и маркер зрелых эпителиоцитов — белок CK3 (рис. 1, в).

Рис. 1. Изображения первичной культуры эпителия роговицы.

а — фазово-контрастная микроскопия; б — флуоресцентная микроскопия, окрашивание на цитокератин 19 (красный канал), ядра докрашены Hoechst (синий канал); в — флуоресцентная микроскопия, окрашивание на цитокератин 3 (красный канал), ядра докрашены Hoechst (синий канал).

Из лимбальной ткани также были выращены клетки, имеющие более мезенхимальное строение — вытянутые, звездчатой формы, экспресирующие виментин (рис. 2).

Рис. 2. Изображения первичной культуры клеток из зоны лимба роговицы.

а — фазово-контрастная микроскопия; б — флуоресцентная микроскопия, окрашивание на виментин (красный канал), ядра докрашены Hoechst (синий канал).

Известно, что синдром сухого глаза достаточно часто возникает при продолжительном лечении глаукомы, включающем инстилляции гипотензивных лекарственных средств [1]. В состав подавляющего большинства таких препаратов входят вспомогательные компоненты, обеспечивающие стабильность действующего вещества и препятствующие росту микрофлоры. Наиболее часто таким компонентом является бензалкония хлорид (БХ), четвертичное аммониевое соединение, характеризующееся значительной активностью в отношении широкого спектра микроорганизмов (кроме микобактерий и спорообразующих возбудителей). Механизм токсического действия БХ связан с нарушением структуры клеточной мембраны патогенов, денатурацией белков и ингибированием ферментов. Как катионный детергент БХ разрушает липидный слой слезной пленки, вызывает внутриклеточные изменения эпителиоцитов, нарушая их барьерную функцию и создавая условия для проникновения в переднюю камеру и задние отделы глаза.

В связи с этим были проведены исследования, направленные на выяснение степени цитотоксичности антиглаукомного препарата латанопроста (с БХ в составе) и возможности протекции с помощью двухкомпонентного слезозаменителя на культуре клеток, полученных из зоны лимба [2]. Предварительно было показано отсутствие цитотоксичности слезозаменителя. В тестах на метаболическую активность и морфологическую сохранность выявлено, что их совместное применение снижает повреждающее воздействие консервантного антиглаукомного препарата на клетки (рис. 3).

Рис. 3. Диаграмма сохранности клеточной мембраны по результатам теста на исключение красителя трипанового синего.

СЛ — слезозаменитель; Латанопрост/БХ — антиглаукомный препарат; * — различие с контролем статистически значимо; # — различие с группой Латанопрост/БХ статистически значимо.

Восстановление эпителиального слоя роговицы после различных модификаций кератопластики остается актуальной проблемой. В связи с этим разрабатываются новые способы индукции регенерации, а одним из перспективных подходов в этой области является применение аутологичных производных крови, обладающих высоким регенераторным потенциалом. На эпителиальной культуре клеток роговицы были протестированы различные дериваты крови (сыворотка, плазма, обогащенная тромбоцитами, плазма, обогащенная факторами роста) в качестве промоутеров эпителизации. Анализировали скорость заживления экспериментальной раны монослоя и влияние стимуляторов на пролиферацию клеток [3].

Выявлено, что все три типа производных крови являются промоутерами реэпителизации роговицы (рис. 4). Наиболее выраженный эффект был получен при применении плазмы, обогащенной факторами роста. На основании полученных данных проведена клиническая апробация наиболее эффективной композиции из дериватов крови и получены положительные результаты ускорения эпителизации после различных вариантов кератопластики [4].

Рис. 4. Диаграмма уровня метаболической активности эпителиальных клеток по результатам MTS-теста после 24-часовой инкубации со стимуляторами.

1 — плазма обогащенная факторами роста; 2 — обогащенная тромбоцитами плазма; * — различие с контролем статистически значимо; ** — различие с ПОбФР статистически значимо.

Как правило, модельные культуры исследуют в 2D-условиях, то есть распластанными на пластике. В настоящее время осуществляется активный переход к объемному культивированию, что максимально приближает модель к естественным условиям. Задача нашего исследования связана с оценкой в условиях 3D-культивирования биосовместимости с клетками лимба роговицы человека различных матриксов на основе коллагена (гемостатической коллагеновой губки и офтальмологического дренажа iGen).

Полученные результаты свидетельствуют о высокой биосовместимости обоих типов исследуемых скаффолдов (рис. 5) и их низкой цитотоксичности, что предполагает возможность их использования в качестве тканеинженерных конструкций, препятствующих фиброзированию (в том числе в хирургическом лечении глаукомы) [5].

Рис. 5. Изображение тканеинженерных конструкций из клеток лимба, заселенных на матрицу из пористого коллагена, флуоресцентное витальное окрашивание Calcein-AM (зеленый канал), аутофлуоресценция коллагена (голубой канал).

а — гемостатическая губка; б — дренаж iGen.

Эндотелий

Снижение плотности эндотелиальных клеток (ЭК) приводит к повышению проницаемости роговицы для водянистой влаги и, как следствие, к отеку стромы, образованию булл и постепенному снижению прозрачности роговицы. Причинами снижения плотности ЭК могут быть как генетически детерминированные состояния (например, эндотелиальная дистрофия Фукса), так и развитие буллезной кератопатии вследствие повреждения клеток при интраокулярных хирургических вмешательствах. Кроме этого, плотность ЭК может снижаться на фоне воспалительного процесса структур переднего сегмента глаза или реакции отторжения кератотрансплантата [6].

Как известно, частым коморбидным состоянием указанных патологий является офтальмогипертензия, требующая длительного назначения гипотензивных препаратов. Исходя из этого, представляет интерес оценка потенциального негативного воздействия как непосредственно лекарственных препаратов, так и консерванта БХ на состояние эндотелиального слоя роговицы.

В сравнительном исследовании было изучено влияние гипотензивных препаратов различных фармакологических групп на эндотелий роговицы человека in vitro [7,8]. В ранее проведенных иммуногистохимических исследованиях были выявлены характерные морфологические изменения эндотелиального слоя при эндотелиальной дистрофии Фукса и псевдофакичной буллезной кератопатии, к которым относится в том числе снижение плотности ЭК и контактов между ними [9]. Исходя из этого, в качестве клеточных моделей для оценки действия лекарственных средств были использованы два типа культур:

— плотные колонии ЭК с сохранными межклеточными контактами, которые расценивали как монослой (аналог интактного эндотелия in vivo) (рис. 6, а);

— ЭК, рассеянные в низкой плотности, без межклеточных контактов, которые расценивали как аналог измененного эндотелия при эндотелиальной дистрофии Фукса и буллезной кератопатии различного генеза in vivo (рис. 6, б).

Рис. 6. Изображение исследуемых клеточных моделей, фазовый контраст.

а — модель монослоя; б — модель низкой плотности ЭК.

Экспозицию ЭК проводили в течение 24 ч с бримонидином, дорзоламидом, тимололом (с БХ и без него). Учитывая вероятное повышение проницаемости роговицы, обусловленное нарушением структуры эпителия и других слоев при эндотелиальной дистрофии Фукса и буллезной кератопатии различного генеза, изучали цитотоксическое действие лекарственных средств в разведениях, соответствующих максимальной концентрации (Cmax) действующих веществ во влаге передней камеры глаза после однократной инстилляции, а также превышающих Cmax в 10 и 100 раз (концентрации рассчитывали по результатам работ A.A. Acheampong и соавт., 2002, V.H. Lee и соавт., 1991, T. Loftsson и соавт., 2012). Влияние БХ было оценено в концентрациях, равных его содержанию в изучаемых разведениях лекарственных средств. Морфологические изменения монослоя и отдельных ЭК оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии, а метаболическую активность ЭК отражали результаты колориметрического MTS-теста.

Выявлено отсутствие значимого цитотоксического действия бримонидина, дорзоламида и тимолола (независимо от наличия в их составе БХ) в разведениях, соответствующих Cmax действующего вещества. Анализ влияния бримонидина, дорзоламида и тимолола (без БХ) в концентрации, превышающей Cmax действующих веществ в 10 и 100 раз, свидетельствует о патологических структурных изменениях монослоя эндотелия и отдельных ЭК под влиянием тимолола и только отдельных ЭК под влиянием дорзоламида. По данным MTS-теста, достоверного снижения метаболической активности ЭК после экспозиции с указанными препаратами не выявлено. Вместе с тем при концентрации, превышающей Cmax действующих веществ в 100 раз, и наличии БХ в составе дорзоламид способствует появлению умеренных изменений структуры монослоя клеток, а бримонидин и тимолол приводят к тотальному апоптозу ЭК (рис. 7).

Рис. 7. Изображения характерных изменений, наблюдаемых при 24-часовой экспозиции с лекарственным средством в концентрации, превышающей Cmax в 100 раз.

Фазово-контрастная микроскопия. В скобках даны концентрации в мкг/мл.

Влияние гипотензивных лекарственных средств (с БХ в их составе) на отдельные ЭК проявляется начальными морфологическими изменениями клеток при экспозиции с дорзоламидом и тимололом в концентрациях, превышающих Cmax действующих веществ в 10 раз. В то же время превышение Cmax указанных веществ в 100 раз приводит к снижению метаболической активности ЭК под влиянием бримонидина, дорзоламида и тимолола на 69%, 21% и 79% соответственно (рис. 8). Аналогичные изменения монослоя эндотелия и отдельных ЭК, возникающие при экспозиции с БХ в концентрациях, соответствующих его содержанию в лекарственном средстве, подтверждают, что отрицательное влияние антиглаукомных лекарственных средств на эндотелий роговицы связано с наличием в их составе вспомогательного компонента — БХ.

Рис. 8. Диаграмма метаболической активности изолированных клеток после экспозиции 24 ч с различными концентрациями лекарственных средств, содержащих БХ.

Полученные данные необходимо учитывать в случае назначения гипотензивных препаратов при дисфункции эндотелиального слоя роговицы и изменениях ЭК различного генеза.

Строма

Создание клеточных моделей стромы может способствовать детальному изучению механизмов изменения роговицы различного генеза. В рамках одного из направлений решали задачу экспериментального подтверждения так называемой минеральной гипотезы патогенеза кератоконуса, согласно которой причиной деструктивных изменений стромы роговицы является нарушение нормального распределения и концентраций минеральных элементов (в частности, меди, железа и цинка) [10].

Как известно, клеточные технологии позволяют воспроизводить тканеподобные структуры в различных вариантах (сфероиды, графты, пласты). Исходя из этого, на первом этапе данного исследования решали задачу выбора наиболее подходящего варианта культивирования тканеподобной структуры как модели стромы роговицы. Вторая задача была связана с изъятием из клеточного окружения интересующего химического элемента, а третья задача заключалась в апробировании выбранной клеточной модели в условиях искусственного обеднения питательной среды определенным химическим элементом.

Установлено, что для решения поставленной задачи оптимальным является вариант культивирования клеточного пласта без дополнительного носителя (рис. 9).

Рис. 9. Изображение клеточной конструкции, выращенной из кератоцитов в высокой плотности без дополнительного носителя.

а — полутонкий срез, окраска метиленовым синим и фуксином; б — сканирующая электронная микроскопия. Звездочками отмечены некоторые ядра.

Вопрос деплеции минеральных элементов был частично решен путем подбора режима обработки сыворотки ионообменной смолой, при котором в окружении кератоцитов на порядок снижается концентрация цинка — одного из ключевых минералов, задействованных в энзимопатии при кератоконусе.

Таким образом, задача создания клеточной модели, адаптированной к последующим тестам, была решена путем формирования клеточных пластов, повторяющих пространственное взаимно перпендикулярное ламеллярное строение роговичной стромы, и подбора метода обеднения питательной среды [11].

Слизистая оболочка носослезного протока

Рубцовое заращение дакриостомы — одна из основных причин снижения эффективности эндоназальной дакриоцисториностомии. Поиск препаратов, препятствующих излишней продукции фибропластической ткани, то есть обладающих антифибротической активностью, возможно проводить in vitro. На клеточной культуре фибробластов слизистой оболочки полости носа было проведено исследование антифибротических свойств препарата «Пирфенидон». Первичные культуры были получены из биоптатов, взятых в процессе эндоназальной эндоскопической дакриоцисториностомии. Исследовали токсичность препарата в концентрациях 0,01—0,5 мг/мл при помощи метаболического теста, а также ингибирующее влияние препарата на миграцию фибробластов на модели раны монослоя (рис. 10). Согласно имеющимся данным, препарат «Пирфенидон» может проявлять антифибротические и противоспалительные свойства.

Рис. 10. Изображения, иллюстрирующие динамику заращения раны монослоя при добавлении препарата «Пирфенидон».

Фазово-контрастная микроскопия.

Выявлено, что препарат «Пирфенидон» не обладает цитотоксичностью по отношению к фибробластам слизистой оболочки носа, однако оказывает выраженный дозозависимый ингибирующий эффект на скорость их миграции. В контрольной группе после инкубации в течение 24 ч восстановление клеточного монослоя произошло практически полностью (на 85%). В опытных лунках при добавлении препарата монослой восстановился только на 8% и 2% при концентрации 0,15 мг/мл и 0,3 мг/мл соответственно.

В дальнейшем эти данные были использованы при тестировании препарата in vivo на модельных животных. Предварительная ориентировка по эффективным концентрациям, проведенная in vitro, позволила снизить количество экспериментальных животных, включенных в это исследование.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования клеточных культур в качестве модельного объекта для решения различных задач как фундаментального, так и прикладного характера. Потенциальные направления исследований могут быть связаны с уточнением механизмов развития глазных заболеваний, разработкой и оценкой эффективности методов лечения, профилактикой осложнений, обусловленных назначением лекарственных средств.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.